附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测及药物治疗效果的观察

附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测及药物治疗效果的观察 摘要 [目的]：检测附红细胞体感染小鼠后的血液学指标变化拟对附红细胞体的发病机理进行探讨。对附红细胞体感染小鼠进行药物治疗效果观察，以便为临床合理用药奠定科学基础。[实验方法]：1. 附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测：用了光学显微镜镜检、透射电镜观察以及PCR检测方法检测附红细胞体。将感染附红细胞体的患者进行附红细胞体的分离纯化并作为感染源注射SPF级昆明小鼠，感染后通过血液压滴片镜检，PCR检测及透射电镜检测鉴定模型建立成功，检测红细胞膜ATP酶活性、血液常规指标、红细胞SOD酶活性、红细胞免疫功能、一氧化氮含量。 2．附红细胞体感染小鼠的药物疗效观察：随机将48只感染附红细胞体的小鼠分成4组，每组12只。第一组为感染组，第二组为感染后不治疗组称为阳性对照组。第三组为青蒿琥酯治疗组，剂量为60mg/kg，第四组为丁胺卡那霉素联合青蒿琥酯治疗组，丁胺卡那霉素的剂量为400mg/kg，青蒿琥酯的剂量为60mg/kg，连续治疗7天。再取12只正常小鼠为阴性对照。每天从感染的小鼠各采血制成鲜血压滴标本，油镜镜检。观察其感染率，测定血液常规指标，在治疗7天后，对血样进行PCR检测。 [结果]：鲜血滴片镜检和瑞氏-姬姆萨染色涂片均能清晰地观察到附红细胞体的形态结构，通过透射电镜可以观察到附红细胞体的超微结构，发现附红细胞体附着于红细胞表面。根据已有的猪附红细胞体特异性片段设计引物，成功地扩增得到801bp 的PCR产物。附红细胞体感染组小鼠的红细胞数量显著低于正常组小鼠的红细胞数量（P<0.01），附红细胞体感染组小鼠的血红蛋白含量、RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量显著低于正常组小鼠的血红蛋白含量、RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量（P<0.05）附红细胞体感染组小鼠的红细胞压积、SOD酶活性略低于正常组小鼠的红细胞压积、SOD酶活性（P>0.05）附红细胞体感染组小鼠的嗜中性粒细胞数略低于正常组小鼠的嗜中性粒细胞数（P>0.05）附红细胞体感染组小鼠的白细胞总数、淋巴细胞数、NO含量略高于正常组小鼠的白细胞总数、淋巴细胞数、NO含量（P>0.05），附红细胞体感染组小鼠的RBC-IC花环率高于正常组小鼠的RBC-IC花环率（P<0.05）。 各组的感染情况见图1和表2，经过青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素治疗，附红细胞体感染率逐渐降低，到给药结束，红细胞已恢复正常，并且在给药后第5天，感染率降为0%，单用青蒿琥酯治疗到给要结束红细胞基本恢复正常。阳性对照组在未经治疗后的第7天附红细胞体的感染率为21.08%，与青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素组、青蒿琥酯治疗组相比有显著性差异（P<0.05）。经过药物治疗后，青蒿联合丁胺卡那霉素组和青蒿琥酯组的红细胞数明显增加（P<0.01）、血红蛋白含量明显增加（P<0.05）、而各组的红细胞压积相比无显著性差异（P>0.05）。各组小白鼠血液样本经PCR检测，感染组和阳性对照组出现特异性片断，青蒿琥酯组和青蒿联合丁卡组未扩增出特异性片断。 [结论]：1．采用鲜血滴片镜检，瑞氏-姬姆萨染色镜检，透射电镜镜检的方法均可作为检测附红细胞体的手段。但是光学显微镜镜检存在一定的不足和缺陷，本文采用了PCR检测和透射电镜检测方法可以特异性检测出附红细胞体。临床应用中，可将光学显微镜检和分子检测、透射电镜检测方法相结合，取长补短，作为附红细胞体病的检测方法。 2．附红细胞体可以感染SPF昆明小鼠。采用6周龄昆明小鼠作为实验动物，以纯化的人附红细胞体作为感染源攻毒，可以使SPF昆明小鼠感染人附红细胞体，成功地建立了感染模型。 3．本实验在所建立的SPF小鼠感染模型的基础上，研究了附红细胞体感染所引起小鼠血液学指标的变化，附红细胞体感染组小鼠与正常组小鼠相比：红细胞数量明显减少，血红蛋白含量明显下降、红细胞压积略有下降、嗜中性粒细胞数减少、白细胞总数和淋巴细胞数略有增加，RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量、SOD酶活性明显降低， NO含量、RBC-IC花环率明显增加。因此附红细胞体感染造成红细胞膜结构发生变形，使红细胞易于溶解和破裂，造成血液中生理生化指标发生改变，红细胞内外阳离子平衡失调、造成红细胞免疫功能低下。 4．青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素治疗比单用青蒿琥酯治疗效果好，能迅速清除体内附红细胞体，使红细胞的功能和数量迅速恢复正常，使得机体彻底康复。 1．引言 附红细胞体病是附红细胞体寄生于猪、牛、羊等动物红细胞或血浆中引起的一种传染病，主要以发热、贫血、黄疸为主要临床症状。随着畜牧养殖业的不断发展，本病也有不断蔓延的趋势，全国大多数地区基本都有本病发生，给我国畜牧养殖业造成严重的经济损失，成为危害当前畜牧养殖业的主要疾病之一。 附红细胞体在全球发现的历史较早。1928年，Schillig和Dingen等几乎同时在啮齿类动物中查到类球状血虫体（E.coccoides）[2]；1932年Doyle[3]在印度首次报道了“猪的一种立克次氏体病或类微粒孢子虫病”；而后在1934年由Neitz等[4]在绵羊红细胞上或在其周围发现有多形态的微生物寄生，将其命名为绵羊附红

细胞体(E.ouis)；Adler等[5]在牛体中也发现形态与类球状血虫体相似的微生物；而Kinsely等[6]则揭示了猪的类边虫科病原体引起的疾病；1950年Splitter等[7]证实了Kinsely 等发现的类球状血虫体是引起猪黄疸贫血病(Ictero-anaemia)和类边虫病(Anaplasmosis-like disease)的真正病因，并将此病原命名为猪附红细胞体( E.suis )。1986年，Puntaric等[8]正式描述了人的附红细胞体病。我国是附红细胞体病感染最为严重的国家之一，但是对于此病的研究较晚。1981年晋希民[9]最先报道了兔附红细胞体病；随后1982年许耀成等[10]首次在江苏南部查到猪附红细胞体（E.suis）；1990年全炳昭首次报道了犬的附红细胞体病；1991年华修国[11，

12]在上海发现犬的附红细胞体病和仔猪附红细胞体病，随后相继有许多报道在畜

禽中发现存在附红细胞体病。1991年内蒙自治区邰秀珍等[13]在国内首次报告人的附红体病病例；1992年，冯立明、裴标等又先后报道了人附红细胞体病[14]；1993年，我国在卫生部的关注下，组成了附红细胞体病调查组，由尚德秋等人对此病进行了系列的流行病学研究，并证实了附红细胞体病在人群中的感染情况。 目前我国是附红细胞体病流行最为严重的国家之一, 该病已经对人类生命安全构成威胁,但是该病并没有引起人们的高度重视，因此我们应对该病提高警惕。 2. 病原学 2.1 附红细胞体形态学 由于附红细胞体的宿主种类繁多，宿主的发病阶段也不尽相同，这些因素造成所观察到的附红细胞体的形态结构有所差异，表现出多样性。1985年Zachary等[15]和1992年Liebich等[16]分别报道，在电镜下可见猪附红细胞体主要有三种形态，即球形的未成熟的附红细胞小体和盘形的幼年附红细胞体以及环形的成熟的附红细胞体。也就是代表了猪附红细胞体发展的三个不同发展阶段。光镜下的附红细胞体呈环形、小球状、卵圆形或杆状等多种形态，有折光性，大小从0.3～2.6 um不等。附红细胞体无细胞壁，仅有单层界膜，无明显的细胞膜和细胞器，整个结构呈单层膜包被的圆盘状。它们单独或成链状附着在红细胞表面，或围绕在整个红细胞上，在血浆中也可见到自由游动的附红细胞体。附着于红细胞表面的附红细胞体则较难看出其运动性，而游离于血浆中的附红细胞体可见做摇摆、扭转、翻滚等运动[17]。据报道猪附红细胞体外有一层膜包被，在包浆膜下有直径10nm的微管，有核糖体颗粒，无明显的细胞及核的结构。这些生物体黏附于红细胞的表面的浅凹窝和深沟内，而不是穿入红细胞的内部，由一个15～

25 nm的清晰区域将其与红细胞分隔开。这些生物体表面有纤丝，这些纤丝穿过清晰区域扒嵌在宿主红细胞上，该结构可进一步解释红细胞因纤丝扒嵌其表面引起红细胞膜产生凹陷、变形，导致红细胞结构和功能改变，乃至破碎溶血的原因[18，19]。 2.2 生物学特性 附红细胞体在动物机体内存在方式有两种，一是游离于血浆中，另一种是附着于红细胞表面。关于附红细胞体的运动性，多数学者认为游离于血浆中的附红细胞体能自主地作上升、下降、前后翻滚、扭转等不规则运动，其中单个大型附红细胞体活动弱于小型附红细胞体，而聚集成团状者活动力减弱或无活动力。 关于附红细胞体的染色特性，认为苯服色素易于着染，革兰氏染色为阴性，姬姆萨氏染色呈紫红色，瑞氏染色呈淡兰色[20]。而在吖啶橙染色则呈现出两种不同的荧光，一种为较大的呈现桔红色荧光的附红细胞体，提示有RNA的存在，另一种为较小的呈现淡绿色荧光的附红细胞体，提示有一定数量的DNA存在。因此，推测附红细胞体的遗传物质可能包括分别为DNA和RNA的两种类型。 附红细胞体不受红细胞溶解的影响，对干燥、热和化学药品敏感，对低温的抵抗力较强。一般常用消毒药均能杀死病原，如在5g∙L-1石炭酸中37℃3 h就可以被杀死，在含氯消毒剂中作用1 min即全部灭活。在含碘消毒剂中，附红细胞体很快停止运动并失去活性，用无菌PBS洗涤后，也不能恢复其活动力，更无感染力[21]。 附红细胞体对温度较敏感。在75℃-100℃水浴中作用30s-1 min，附红细胞体即失去活性，停止运动。在0℃-4℃冰箱中，附红细胞体可存活60d，并保持其感染能力，达到90d时，仍有近30%左右的附红细胞体具有活动力[22]。附红细胞体对干燥也很敏感。将附红细胞体悬液滴于玻片上，置室温使其自然干燥，在1 min内，将涂片上附红细胞体复溶后，一部分附红细胞体仍有活动力，但很弱。2 min后，片子上的附红细胞体全部停止活动[23]。 2.3 分类和分子病原学 目前，关于附红细胞体的分类问题，国内外尚有争议，世界范围内对附红细胞体的归属尚不统一。有学者认为附红细胞体应归属于立克次氏体，也有学者认为应归属于原虫，还有学者认为应归属于霉形体目[24，25，26]。国际上广泛采用《伯杰氏细菌鉴定手册》统一分类，将附红细胞体列为立克次氏体目(Rickettsiales)、无浆体科(Anaplas-mataceae)、附红细胞体属(Eperythrozoon)。但是近年来有分子生物学的证据对病原的基因序列(16SrRNA)分析结果表明，有些附红细胞体如寄生于鼠类的球状附红细胞体(E.coccoides)、寄生于羊(绵羊和山羊)体内的羊附红细胞体(E. ovis)、寄生于猪体内的猪附红细胞体(E. suis)和小球附红细胞体(E. parvum )及寄生于牛体内的温氏附红细胞体(E.wenyonii)的16S rRNA 序列更接近于支原体属(Mycoplasma)生物的16SrRNA 序列，因而提议应该将巴通体属及附红细胞体属的生物都统一归类为柔膜体纲支原体属。但Μilenberg等认为将这2个属的所有种都归类为支原体属的证据并不很充分。因为并不是所有的巴通体属和附红细胞体属的生物的16SrRNA基因序列与支原体属都有高的同源性。因此，附红细胞体的分类及各种属附红细胞体的致病性尚有待于进一步深入研究。 附红细胞体病的分子病原学研究尚不够深入。迄今为止，对附红细胞体基因组知道的很少。已在Genebank上登录了10个包括猪的、狗的、猫的、羊的、牛的等种属的16S rRNA序列，和11个开放阅读框的基因序列，尚没有已知功能基因的报道。Messick等[27]用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和限制性酶切片段测定了猪附红细胞体的基因组，是环形的DNA，全长约为730-770 kb，通过Southern杂交表明，16S rRNA基因座落在120 kb MLuⅠ，128 kbNruⅠ，25 kb SacⅡ和217 kb SalⅠ片段上。