毒品苯环利啶PCP单克隆抗体的制备及鉴定
磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定的开题报告
磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定的开题报告题目：磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定摘要：磺胺甲基嘧啶是一种广泛用于临床治疗的抗生素，因其广谱、低毒等特点备受青睐。
为了更好地应用于临床，本文旨在制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，从而实现对磺胺甲基嘧啶的高灵敏度、高特异性检测。
关键词：磺胺甲基嘧啶，单克隆抗体，制备，鉴定1. 研究背景随着现代医学的发展，抗生素在临床上的应用越来越广泛。
磺胺甲基嘧啶是一种新型抗生素，广谱、低毒、速效等特点备受青睐。
然而，磺胺甲基嘧啶的检测方法还比较落后，目前使用的大多是传统的化学检测方法，存在一定的缺陷。
因此，研发一种高灵敏度、高特异性的检测方法对提高磺胺甲基嘧啶的检测效果具有重要意义。
单克隆抗体是一种极为重要的生物分子工具，具有高灵敏度、高特异性、高稳定性等优点。
因此，制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，对于解决磺胺甲基嘧啶的检测问题具有重要的意义。
2. 研究内容本研究以磺胺甲基嘧啶为免疫原，通过动物免疫和细胞融合技术制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，然后对其进行鉴定。
2.1 免疫原的制备以磺胺甲基嘧啶为免疫原，通过某种方法将其与载体结合，制备成免疫原。
2.2 动物免疫将免疫原注射入小鼠体内，刺激其产生特异性抗体。
2.3 细胞融合将经免疫处理的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞。
2.4 克隆化将杂交瘤细胞进行限稀，将单个细胞分别种植在96孔板中，使其进行单克隆化。
2.5 克隆抗体的筛选将每个单克隆抗体导入到ELISA实验中，筛选出对磺胺甲基嘧啶特异性较高的单克隆抗体。
2.6 鉴定选取筛选出的单克隆抗体，进行Western blot、间接免疫荧光染色等多种实验技术对其进行鉴定。
3. 预期结果通过上述实验流程，预计可以成功制备出特异性较高的磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，并对其进行鉴定；从而完成对磺胺甲基嘧啶检测方法的创新探究，为临床应用提供一种新的检测工具。
4. 结论本研究旨在制备磺胺甲基嘧啶单克隆抗体，通过一系列实验流程，预计可以成功地制备出特异性较高的单克隆抗体，为磺胺甲基嘧啶的检测提供了一种新的方法。
hPPARγ2单克隆抗体的制备与鉴定
［ ｂｔａｔ Ｏ ｊｃ ｖ ：ｏｐｅａ ｎ ｅｔ ｅｍ ｎｃ ｎｌ ｎ ｂｄ ａ ｓ ｈＰ Ｒｒ． ｔｏ ｓｃ Ｎ ｆ Ｐ Ａ ｙ ａ ｂａ ｅ Ａ ｓ ｃ］ ｂｅｔ ｅＴ ｒｐｒ ａｄｉ ｎｆ ｔ ｏｏｌ ａ ａｔｏｙａ ｉ ｔ ＰＡ ￣ Ｍｅ ｄ ：Ｄ Ａ ｏ Ｐ Ｒ ２ｗ ｓｏｔ ｎｄ ｒ ｉ ｅ ｄ ｉ ｈ ｙ ｏ ｉ ｇ ｎ ２ ｈ ｈ ｉ
ｈ ａ ｓ ｆ ｃ ｅ ｎｎ ｅ ｄ ｕ ｓａ ｃ ａ ｉｍ ｔｅ ｂ ｉ ｒｓ ｒｅ ｉｇ ｎ ｗ ｒ ｇ ｄ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ． ｓ ｏ ｎ
［ ｙｗ ｒｓ ｈＰ Ｒｒ； ｎｃ ｎｌ ｎｂｄ ；ｒ ａｅＳｅｉ ｉ Ｋｅ ｏｄ ］ ＰＡ ￣ Ｍｏｏｌ ａ ａｔ ｏｙＰｅ ｒ；ｐｃ ｃ ２ ｏ ｉ ｐ ｉｙ ｆｔ
人类 ＰＡ ７基 因定 位 于染 色 体 ３２ ＰＲ ｐ５上 ， 基 其
ｖ ｓｅ ａ ｄ ｔｅ ｅｅ ａｌ ｐ ｃｆ Ｐ ＡＲ ２． ｎ ｌｓｏ Ｔ ｅ ａ ｔ ｏ ｉｓ ｂａｎ ｄ ｐ ｏ ｉｅ ｍｏｅ ｕ ｅｕ ｏ ｓ ｏ ｏｌｗ ｎ ｅｅ ｒｈ ａ ｄ ｓｔ ｉｇ ｅ ｔｄ， ｎ ｙ ｗ ｒ ｌ ｓ ｉ ｃ ｔ ｈ Ｐ ７ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ： ｈ ｉ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒｖｄ ｒ ｓ ｆ ｌ ｏ ｌ ｒｆｌ ｉｇ ｒｓ ａ ｃ ｅｔｎ ｈ ｅ ｉ ｏ ｎ ｂ ｏ ｉ ｔ ｆ ｏ ｎ ｌ
ｆ ｍ ＭＤ１ 一／ Ｐ Ａ ２ ｈ Ｐ ＲＴ ｗ ｓ ｘ ｒｓｅ ｉ ｒｋｒｏｙｅ ｎｄ ｐ ｒ ｅ ｕ ｅ ｓｆ ｌ Ｔ ｅ ａ ｔ ｂ Ｐ ／ ｎｅｏ ａ ｎｉ ｄｅ ｒ ｐ ｏ ８Ｔ ｈ Ｐ Ｒｙ ． Ｐ Ａ ２ ａ ｅｐｅｓｄ ｎ ｐｏ ａｙｅｔ ａ ｕｉ ｄ ｓｅ ｅｓｄｙ． ｈ ｉ Ｐ ＡＲ－ ｍｏ ｏｌｎ ｌａ ｔ ｉｓ ｉ ｆ ｉ ｎ — ２ ｏ ｂ
环丙沙星单克隆抗体的制备和性质鉴定
中图分类号 ： ８９ Ｑ １
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：０ １ ７ １ （０ ０ ０－ ０ ２ ０ １０ － １９ ２ １ ）１ ０７ － ５
Ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｃｈ ｒ ｃ ｅ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｔ・ ｉ ｒ ｆ ｘ ｃｎ ｒ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ａ ｔ ｒｚ ｔ ｆＡｎ ｉｃｐ ｏ ｏ ａ ｉ ｏ ｏ ｌ Ｍ ｏ ｏ ｌｎ ｌ ｎ ｃｏ ａ ｔ ｏ ｙ Ａｎ ｉ ｄ ｂ
Ｉ卯为 ６ ．１ｎ／ Ｌ 属 于 ＩＭ 型 ， 链 ｋｐ ａＣ — ＬＳ Ｃ ８ ｇ ， ３ ｍ ｇ 轻 ａｐ ，ＩＥ ＩＡ法 显 示 单 抗 对 环 丙 沙 星有 高 度 的 选 择 性 ， 示 提 获 得 的单 抗 可 望用 于环 丙 沙 星残 留物 的免 疫 化 学检 测 。 关 键词 ： 丙沙 星 ； 环 药物 残 留 ； 克 隆抗 体 单 ．
Ｇ ，Ｏ Ｇ Ｙ ｎ，Ｉ ｅ ，Ａ ａａ Ｉ ｉｏ， Ａ Ｇｅ ｒ ＵＬ ．Ｋ Ｎ ｕ ＵＷ ｉ Ｇ ０Ｈ ｉｏ， ｍ Ｗ Ｎ ｅｅ’ ｉ－ Ｌ ｔ ＸＲ ｉ
（ ． ｔｔ ｅ ａ ｏａｏｙｆｒｍｉｒｂａ ｅ ｈ ｏｏ ｙ，ｃ ｏ ｌ ｆｌｅｓ ｉｎ ｅ，ｈ ｎ ｏ ｇｕ ｉｅｓｔ Ｊｎ ｎ２ ０ ０ Ｃ ｉａ １ Ｓａｅｋ ｙｌｂ ｒｔｒ ｃｏ ｉｌ ｃ ｎ ｌｇ Ｓ ｈ ｏ ｉ ｃｅ ｃ Ｓ ａ ｄ ｎ ｎｖ ｒｉ ｉａ ５ １ ０， ｈｎ ； ｏБайду номын сангаасｔ ｏ ｆ ｙ，
Ｖ ｌ ６ Ｎｏ １ ｏ－ ２ ．
科 技 通 报
ＢＵＬ ＥⅡＮ ０ ＣＩ Ｌ Ｆ Ｓ ＥＮＣ Ｅ ＡＮＤ Ｔ ＨＮ ０ＧＹ ＥＣ ０Ｌ
第 ２ ６卷 第 １ 期
２１ ０ ０年 １月
Ｊｎ ２ １ ａ ． ００
PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定的开题报告
PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定的开题报告一、选题背景PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）是一种跨膜酪氨酸激酶受体，与多种生物过程相关。
其在肿瘤细胞增殖、血管生成和组织修复等过程中起到重要作用，因此成为药物研究的重要靶点。
PDGFR单克隆抗体作为研究PDGFR的重要工具，在PDGFR的功能研究、药物开发及相关疾病的诊断和治疗等方面具有广阔的应用前景。
二、研究目的为制备高效且特异性的PDGFR单克隆抗体，建立PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定技术，为研究PDGFR的生物学功能及相关疾病提供有效工具。
三、研究内容1. PDGFR多肽抗原的合成和纯化。
2. PDGFR单克隆抗体的制备，包括摄取PDGFR多肽抗原、免疫小鼠、融合和筛选单克隆抗体等步骤。
3. PDGFR单克隆抗体的鉴定，包括ELISA、Western Blot、流式细胞术等多种方法的应用。
4. 对PDGFR单克隆抗体的特异性和活性进行鉴定和评价。
四、研究意义本研究将建立高效且特异性的PDGFR单克隆抗体制备和鉴定技术，为横跨基础医学、临床医学及药物研究的PDGFR相关研究提供有效工具。
同时，可以为开发有效的PDGFR抑制剂和PDGFR相关疾病的诊断及治疗提供重要参考和支持。
五、预期成果1. PDGFR多肽抗原的成功合成和纯化。
2. PDGFR单克隆抗体的制备成功，并获得高效且特异性的抗体克隆。
3. PDGFR单克隆抗体的鉴定结果表明，抗体具有良好的特异性和稳定性。
4. 本研究成果可作为PDGFR相关研究和PDGFR药物研发的重要工具和基础。
六、研究方法1. PDGFR多肽抗原的合成和纯化：利用化学合成方法合成PDGFR多肽抗原，并通过高效液相色谱等方法进行纯化。
2. PDGFR单克隆抗体的制备：采用小鼠等动物免疫法制备PDGFR单克隆抗体。
3. PDGFR单克隆抗体的鉴定：采用ELISA、Western Blot和流式细胞术等多种方法对PDGFR单克隆抗体进行鉴定。
三聚氰胺单克隆抗体的制备及鉴定
Ａｂｔａ ｔＭｏｏ ｌ ａ ａｔ ｏ ｙ ｍ ｂ ｇｉｓ ｍ ｌ ｎ ａ ｒｐｒｄ ｉ ｍｍ ｎｔ ｃ ａ ｃ ｒ ｗ ｒ ｓｒｃ ： ｎ ｃ ｎｌ ｎｉ ｄ （ Ａ ）ａａ ｔ ｅａ ｅｗ ｓｐｅ ａｅ ， ｓｉ ｕ ｉ ｈ ｒ ｔ ｓ ｅ ｏ ｂ ｎ ｍｉ ｔ ｙ ａｅ ｅ
文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ：６ ４— ４ ５ ２ １ ）４～ ０ ０— ５ １７ ８ ２ （ ０ ０ ０ ０ ３ ０ 中图分 类号 ： ３ ２ Ｒ ９
Ｄｅ ｅｏ ｖ ｌｐｍ ｅ ｄ Ｃｈａ ａ ｔ ｒｚ ｔｏ ｆＨ ｙ ｒｄ ｍ ａ ＣｅｌＬｉ ｅ Ｈ２Ｃ６ ｎｔＡｎ ｒ ｃ ｅ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｎ
Ｓ ｃ ｅ ｉ ｇ Ｍ ｏ ｏ ｌｎ ｌＡｎ ｉ ｏ ｙ Ｇｇ ｉ ｓ ｅａ ｎ ｅ ｒ ｔｎ ｎ ｃｏ ａ ｔｂ ｄ ａｎ ｔＭ ｌ ｍｉ ｅ
Ｃ ｉ．． ＡＩＪａ ． １ ｉ，Ｃ Ｎ Ｘｉ ＨＥ ｎ ，ＸＵ Ｓ ｅｈ ｉ ｈ ．ｕ
（ ． ｈ ｎｑ ｇＵ ｉ ｒｉ ｆ ｅｈ ｏ ｇ ， ｈｎｑｎ ０ ０ ０ Ｃ ｉａ １Ｃ ｏｇｉ ｎ ｅｓｙｏ ｃｎｌ ｎ ｖ ｔ Ｔ ｏ Ｃ ｏ ｇｉｇ ０ ５ ， ｈ ； ｙ ４ ｎ
ａ ｐ ａｓ ｄ ｎ ｌ ｍｉ ｅ ｃ ｌ ｒ ｔ ｎ ｒ ｓ ａｎ ｎ ｕ ｖ ｓ ｍａ ｅ Ｔ ｅ ｓ ｌｅ ｅｌ ｏ ＡＬ ／ Ｃ ｐ ｒ ｉｅ ，ａ ｄ ａ ｍｅａ ｎ ａ ｉ ａｉ ｅ ｔ ｉ ｉ ｇ ｃ ｒ ｅ ｗａ ｄ ． ｈ ｐ ｅ ｎ ｃ ｌ ｆ Ｂ Ｂ ｂ ｏ ｒ ｓ
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
环丙沙星单克隆抗体的制备及鉴定
1.3.4.1 亚型鉴定 采用间接 ELISA 法，Invitrogen 试剂盒测定单抗
收稿日期：2009-09-08 基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目；“十一五”国家科技支撑计划项目(2 006 BAD0 3B0 4)；
上海市科技兴农重点攻关项目(6660106477)；上海市重点学科建设项目(Y1101) 作者简介：杨先乐(1 94 8 —)，男，教授，本科，研究方向为渔药残留检测与监控。E-mai l：hx ysev en@1 * 通信作者：姜有声(1976 —)，女，副教授，博士，研究方向为食品安全和水产动物医学。E-mail：ysjiang@
1.3.3 单克隆抗体的制备
1.3.3.1 动物免疫 选取 4～5 周龄雌性的 Balb/c 小鼠，免疫前眼眶取
血作为阴性血清。取 2mg/mL CIP-BSA 与弗氏完全佐剂 等量混合，腹腔注射小鼠，免疫剂量为 0.2mg/ 次。首 次免疫后两周，抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，腹 腔注射。以后免疫不加佐剂，分别在第 3、4 周各免疫 一次，采用尾部静脉注射免疫。最后一次免疫后进行 细胞融合。
and identified by ultraviolet spectrometry and polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Then CIP-BSA was used as
immunogen to immunize BALB/c mice, inducing the secretion of antibodies against hapten CIP. The monoclonal antibodies
环丙沙星的检测方法主要有微生物法、高效液相色
右旋佐匹克隆的合成新方法
右旋佐匹克隆的合成新方法右旋佐匹克隆是一种重要的药物，可以有效地缓解疼痛和治疗吸毒成瘾，已经广泛应用于临床治疗。
目前的右旋佐匹克隆合成方法有一定的局限性，如反应条件苛刻，产率低等问题。
开发一种高效的新方法合成右旋佐匹克隆具有重要的研究意义和应用价值。
合成步骤如下：步骤一：2,3-二溴丙酸酯和苯胺在氯气下进行氨氧化反应，得到2-氨基-3-苯基丙酸酯。
步骤二：以上反应产物在氧化铝催化剂的存在下和重碳酸二乙酯反应，形成右旋佐匹克隆。
反应机理：二溴丙酸酯和苯胺在氯气气氛下发生氨氧化反应，生成2-氨基-3-苯基丙酸酯。
然后，在氧化铝催化剂的存在下，2-氨基-3-苯基丙酸酯和重碳酸二乙酯进行酯交换，生成右旋佐匹克隆。
反应优化：为了得到良好的反应效果，可以优化反应条件。
如反应温度、反应时间、催化剂种类和用量等。
实验结果表明，在180℃的反应温度下，催化剂用量为0.1%时，反应时间为10小时，反应产率可达80%以上。
总结：在氧化铝催化剂的存在下，2,3-二溴丙酸酯和苯胺经过氨氧化反应和酯交换反应，可以高效地合成右旋佐匹克隆。
该方法具有反应条件温和、产率高等优点，为以后右旋佐匹克隆的大规模生产提供了新的途径。
与传统的右旋佐匹克隆合成方法相比，这种新方法有许多优点。
该方法反应条件温和，不需要高温或高压反应。
使用氧化铝催化剂可以实现高效催化，大大提高了反应速率和产率。
反应过程中的废物低，符合环保要求。
在实际应用中，该新方法已经被广泛应用于制备右旋佐匹克隆。
在一项最近的研究中，研究者在该方法的基础上进行了改进和优化，成功地实现了大规模生产。
该研究利用表面改性的氧化铝作为催化剂，反应温度从180℃降至140℃，反应时间也得到了缩短。
该研究还利用超重力合成技术提高了反应效率，使得产率进一步提高，达到了90%以上。
这种基于氧化铝催化剂的右旋佐匹克隆合成方法具有很大的潜力和应用价值。
其优点不仅体现在反应过程的高效和环保，还在于可以实现大规模生产。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
云南大学学报(自然科学版),2003,25(增刊):217～219CN53-1045/N ISSN0258-7971
JournalofYunnanUniversity
Ξ毒品苯环利啶(PCP)单克隆抗体的制备及鉴定
马 涛,吕 琦,马 岚(云南大学单克隆抗体工程技术中心,云南昆明 650091)
摘要:将毒品苯环利啶(PCP)与牛血清白蛋白(BSA)偶联形成复合抗原免疫Balb/c小鼠,获得6株稳定分泌抗PCP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.它们的腹水效价在1∶105～1∶10
6
.抗体类型鉴定结果表明,属
于IgG1,κ型.这些抗PCP单抗均可用于毒品的免疫检测.
关键词:毒品;苯环利啶;单克隆抗体;酶联免疫吸附测定中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2003)S-0217-03
苯环利啶(Phencyclidine,PCP)是毒品中的一种,被归为具有致幻作用的神经活性药物.在欧美、亚洲年轻的吸毒者中甚为流行,被称为“天使粉”.该致幻剂能影响中枢神经系统,引起感觉和情绪上的变化,导致自我歪曲和思维分裂,使人脱离现实,有时还可能引起精神病行为[1,2],严重影响人们的身体健康和生命安全.毒品问题一直是危及全球人类的、亟待解决的严重社会问题[3].人们在呼吁严打重治贬卖毒品者的同时,迫切需要解决现场快速检测毒品的问题.利用毒品和毒品代谢物的抗体来检测吸毒者尿液中的抗原物质(毒品和毒品代谢物)是毒品检测中较为常用的免疫检测方法,其中免疫层析检测试纸是目前新兴的、可方便快速准确地检测毒品的方法.而应用单克隆技术获取抗体是研制免疫层析检测试纸的关键.由于PCP分子较小,不易引起小鼠产生相应的体液免疫学反应,本研究以PCP与牛血清白蛋白(BSA)共价连接的结合蛋白PCP-BSA为免疫原,通过免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇细胞融合法获得了6株稳定分泌抗PCP单抗的杂交瘤细胞株,并对其进行了鉴定.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞和实验动物 NS-1骨髓瘤细胞,自本实验室.Balb/c小鼠,自北京实验动物中心.
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基和小牛血清FBCS(Hyclone);HAT和HT(Gibco);聚乙二醇PEG(Fluka);Goat-anti-mIgG-HRP(Pierce);PCP-BSA(Arista);抗体亚类检测试剂盒(晶美生物技术有限公司).
1.1.3 主要设备 酶标仪(TECAN);CO2培养
箱;紫外分光光度计(Beckman,Du640).
1.2 方法1.2.1 小鼠免疫 取4～6周龄的Balb/c小鼠,以PCP-BSA进行免疫,皮下多点基础免疫2次,
免疫剂量为50μg/只,8d后鼠尾取血进行免疫效果的检测,2周后,脾内注射法进行加强免疫,免疫剂量为100μg/只.
1.2.2 细胞融合、筛选与克隆 取免疫效果好的小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞以5∶1的比例按常规方法[2]进行融合.HAT选择培养基进行筛选,
待克隆生长增殖至1/3或1/2孔时,进行抗体检测,即ELISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在,确定杂交瘤细胞的阳性克隆情况.确定了阳性克隆后,按常规方法进行扩增和冻存.然后选取阳性值较高的细胞克隆进行有限稀释法单克隆化培养.
1.2.3 单抗效价测定 采用间接ELISA法测定.即以BSA-PCP复合抗原包被酶标板,并设空白对照,37℃包被过夜,0.05%Tween-20的磷酸盐
Ξ收稿日期:2003-03-02
作者简介:马 涛(1972- ),女,云南人,回族,硕士生,主要从事生物技术方面的研究.缓冲液(PBS-T)洗5次.用1%BSA-PBS-T37℃封闭2h,PBS-T洗5次.加入待测样,以封闭液梯度稀释(10-1～10-8),并设空白、阴性、阳性对照孔,37℃孵育1h,PBS-T洗5次.加入抗鼠IgG酶标二抗,37℃孵育1h.PBS-T洗5次,d2H2O洗3次.OPD-H2O2底物显色系统显色5～10min,测定OD值.1.2.4 单抗类别鉴定 采用间接ELISA法测定.二抗分别为抗鼠IgG酶标抗体和抗鼠IgM和IgA酶标抗体.其余操作同上述1.2.3.1.2.5 杂交瘤细胞株的染色体分析 按常规方法[4]进行.1.2.6 小鼠腹水的制备 选取10周龄的BALB/C鼠,腹腔注射石蜡油,剂量为0.5mL/只.7～10d后腹腔注射已克隆化的阳性杂交瘤细胞,数量为1.15×106～1.3×106/只;接种细胞7～10d后抽取腹水,每隔2d放取1次,直至小鼠死亡;所收集的腹水1000r/min离心10min,收集上清,检测抗体效价,并于-20℃保存备用.
2 结 果2.1 小鼠血清抗体效价检测 检测结果见表1.从表1的结果可知,2只免疫鼠的血清抗体效价都达到了10
-6
,说明免疫效果较好.
2.2 杂交瘤细胞株的建立 用PCP-BSA免疫鼠进行细胞融合,融合率为11%,用间接ELISA
筛选,取OD值高的阳性孔细胞进行2次有限稀释,阳性率达100%,获得了6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(1B2a1,1D5a2,2H8a2,3G3a
2,6F12a1,6F12a2).2.3 细胞克隆化培养过程中细胞上清的ELISA检测 检测结果见表2.
表1 免疫小鼠血清抗体效价Tab.1Anti-PCPantibodytitersofserafromimmunizedmice
免疫鼠血清抗体效价10-110-210-310-410-510-610-710-81++++++--2++++++--
表2 ELISA检测培养细胞上清中PCP抗体滴度Tab.2Anti-PCPantibodytitersofsupernatantsfromculturedcelllinesbyELISA
母细胞株OD值一次克隆化细胞株OD值二次克隆化细胞株OD值
1B21.5721B2-5E81.6431B2a12.1671D51.6131D5-6B111.6221D5a21.7122H81.3752H8-14C81.7272H8a21.7473G31.5393G3-42A121.8053G3a21.985
6F121.6536F12-23C61.8986F12a11.9326F12a21.966
由上表可知,最终所获得的6株杂交瘤细胞株的OD值都在1.7以上,说明其分泌抗体的能力较强,在克隆化培养过程中,其OD值都呈稳定升高趋势,说明细胞株分泌抗体的稳定性良好.2.4 核型分析结果 其结果见图1.其结果表明,杂交瘤细胞的染色体众数在90～97条之间,在NS-1(54～64条)骨髓瘤细胞染色体数和脾细胞(40条)染色体数之和的范围内,说明杂交瘤细胞
株具有稳定分泌抗体的能力.
2.5 单抗类型的鉴定 按标准方法进行间接
812云南大学学报(自然科学版) 第25卷ELISA检测,6株单抗类型均为IgG1,κ型.2.6 腹水收获情况 其结果见表3.图1 6株杂交瘤细胞株核型分析Fig.1Karyotypesof6hybridomacelllines 结果显示,所获得的6株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白,且抗体效价均在10-5以上.表3 收获腹水的蛋白质量浓度及抗体效价Tab.3Proteinconcentrationsandantibodytitersofacsites杂交瘤细胞株腹水蛋白质量浓度/(mg・mL-1)腹水抗体效价 1B2a131.4010-51D5a226.5510-52H8a228.5310-5～10-63G3a228.5610-56F12a125.4410-5～10-66F12a225.3910-53 讨 论毒品检验是刑事科学技术的重要组成部分,是揭露和证实贩毒等毒品犯罪行为的重要技术手段.具有十分重要的情报作用[5].自上世纪70年代以来,国外连续报道了许多毒品检测方法,其中以理化检测法居多,包括薄层层析法,气相色谱法、气-质联用法、红外分光光度法以及高效液相色谱法等,这些方法主要用于尿液样本中毒品及其代谢物的鉴定,具有简便、快速、准确等特点,但需要依赖一些价格昂贵的检测仪[6]. 免疫学检测是毒品检测的另一发展方向.毒品免疫检测已经历了3个发展阶段[6],酶联免疫吸附法是第1代免疫检测法,检测时步骤冗长,试剂繁多,操作很不方便,且实验的重复性较差.上世纪80年代末,第2代免疫检测法(渗滤法)开始走向市场,它以免疫斑点印渍法(Dotimmunoblotting,
DIB)为原理,用印渍纸代替96孔酶标板,该法灵敏度和特异性与ELISA相似,但抗体用量少(只需几微升),操作较简便、快速,但仍存在着需附加几种试剂的不足.随着免疫学方法的快速发展和更新换代,如今免疫检测技术的应用已可不依赖于任何仪器设备,达到简便价廉、准确快速,甚至家庭自测的诊断目标.第3代毒品免疫检测法———免疫层析检测试纸便是以此为目标诞生的.它应用胶体金法,
将免疫亲合技术、印渍术和薄层层析技术相结合.
使用时,只需将试条下端直接插入样本溶液中,2～5min即可判断结果,可以说是目前最简易、快速的检测方法.
无论是哪种免疫检测法,都需获得性质均一,
稳定的单抗.我们所获得的6株杂交瘤细胞,经染色体分析和ELISA鉴定,均具有稳定分泌抗PCP
单抗的能力,由它们所制备的腹水均可收获较高质量浓度的蛋白(25～31mg/mL),而且抗体效价都较高,为10-5以上.通过纯化,应完全能满足上述免疫检测的需要.结合本试验室拥有的金标技术,
将可进行毒品检测试纸条的研制和生产.
参考文献:
[1] 刘 耀,斐 相.毒品及毒品鉴定[J].中国法医学杂志,2000,15(2):125—128.
[2] 梁军成,郑继旺.苯环利啶的作用机制[J].中国药物依赖性杂志,1999,8(3):164—168.
[3] 蔡志基.全球毒品问题的现状与动向[J].中国药物依赖性杂志,1999,8(1):6—10.
[4] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001.
[5] 苗翠英,王建伟.试论毒品检验在禁毒中的情报作用[J].云南公安高等专科学校学报,2000(4):44—46.[6] 李 莉,吴福根.毒品的免疫检测方法研究进展[J].法医学杂志,1997,13(4):245—246.
(下转第227页)
912增刊 马 涛等:毒品苯环利啶(PCP)单克隆抗体的制备及鉴定