虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究
虎杖苷抗氧化活性研究进展
虎杖苷抗氧化活性研究进展
靳亚静;党玲玲;陈希瑜;张田圆;王彧;邵瑞
【期刊名称】《天津中医药大学学报》
【年(卷),期】2024(43)4
【摘要】虎杖苷是从中药虎杖的干燥根茎中提取的单体化合物,是白藜芦醇的葡糖苷衍生物。
现代药理学研究发现,虎杖苷在许多生物过程中发挥重要作用,包括氧化应激、炎症和细胞凋亡等。
与白藜芦醇相比,虎杖苷因具有更高的抗氧化活性和生物利用度受到广泛关注。
近年来研究发现虎杖苷可以显著改善多种氧化应激相关疾病,如神经退行性疾病、糖尿病、心血管相关疾病等。
文章就虎杖苷在多种临床常见疾病中的抗氧化作用进行综述,以期为虎杖苷的后续研究及开发利用提供参考。
【总页数】8页(P333-340)
【作者】靳亚静;党玲玲;陈希瑜;张田圆;王彧;邵瑞
【作者单位】天津中医药大学中西医结合学院;组分中药国家重点实验室;天津中医药大学中医药研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R285
【相关文献】
1.食用菌抗氧化活性成分及其抗氧化作用机制研究进展
2.细胞抗氧化活性方法在食物抗氧化活性评价中的研究进展
3.天然抗氧化物质的保健功能及抗氧化活性研究
进展4.抗氧化肽来源及其抗氧化活性测定研究进展5.三七活性成分提取、分离纯化及其抗氧化活性研究进展
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取及含量测定
虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取及含量测定一、本文概述本文旨在探讨虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法及其含量测定技术。
虎杖作为一种具有广泛药用价值的天然植物，其中含有的白藜芦醇和白藜芦醇苷是其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。
因此，研究虎杖中这两种成分的有效提取和准确测定方法对于深入理解虎杖的药理作用以及优化其临床应用具有重要意义。
本文将综述当前虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取技术，包括溶剂提取、超声波辅助提取、微波辅助提取等，并评价其优缺点。
本文还将介绍含量测定的常用方法，如高效液相色谱法、紫外可见分光光度法等，并探讨其准确性和可靠性。
通过本文的综述，旨在为虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的深入研究和应用提供有益的参考。
二、虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法虎杖，作为一种具有丰富生物活性的中草药，被广泛用于传统医学中。
其内含的白藜芦醇和白藜芦醇苷具有显著的抗氧化、抗炎和抗肿瘤等生物活性，因此，对这两种成分的提取和含量测定具有重要的意义。
以下将详细介绍虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法。
我们需要新鲜的虎杖根茎，确保其来源清洁、无污染。
随后，将虎杖根茎进行清洗、干燥和粉碎，以便后续的提取操作。
由于白藜芦醇和白藜芦醇苷均具有一定的极性，因此，我们常选用极性溶剂如甲醇、乙醇等进行提取。
这些溶剂能够有效地溶解并提取出虎杖中的目标成分。
常用的提取方法包括浸泡提取、回流提取和超声波辅助提取等。
考虑到效率和提取效果，我们通常采用回流提取法。
具体操作如下：将粉碎后的虎杖粉末与提取溶剂混合，置于回流装置中，加热回流一定时间，使溶剂充分与原料接触，从而充分提取出白藜芦醇和白藜芦醇苷。
提取完成后，需要对提取液进行处理，以去除其中的杂质，提高目标成分的纯度。
常用的处理方法包括过滤、浓缩和干燥等。
通过以上步骤，我们可以有效地从虎杖中提取出白藜芦醇和白藜芦醇苷。
这为后续的含量测定和进一步研究提供了基础。
虎杖中白藜芦醇苷提取分离工艺研究
虎杖中白藜芦醇苷提取分离工艺研究虎杖中白藜芦醇苷是一种具有多种生物活性的天然化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。
为了充分利用虎杖中的白藜芦醇苷并满足市场需求，研究人员进行了白藜芦醇苷的提取和分离工艺研究。
白藜芦醇苷是一种存在于植物中的多元醇类化合物，具有较低的溶解度，因而在提取和分离过程中需要采用适当的方法。
目前常用的提取方法有超声波辅助提取、浸泡提取、水蒸气蒸馏提取等。
其中，超声波辅助提取是一种较为高效的提取方法，它利用超声波的机械作用和热效应来破坏细胞壁，促进白藜芦醇苷的释放。
在超声波辅助提取过程中，首先需要将虎杖样品粉碎成适当的颗粒大小，以增加提取效率。
然后将虎杖样品与适量的溶剂（如乙醇、甲醇等）混合，放入超声波提取仪中进行提取。
超声波的作用下，虎杖中的白藜芦醇苷会逐渐释放到溶剂中。
提取时间和温度是影响提取效果的重要因素，一般来说，提取时间越长、温度越高，提取效果越好。
但是过长的提取时间和过高的温度可能会导致白藜芦醇苷的降解，因此需要找到适当的提取条件。
提取完成后，需要对提取液进行分离和纯化。
常用的分离方法有溶剂萃取、硅胶柱层析、凝胶渗透层析等。
其中，硅胶柱层析是一种常用的分离方法，它可以根据样品中化合物的亲疏水性来进行分离。
在硅胶柱层析过程中，首先需要将硅胶填料充分膨胀，然后将提取液加入硅胶柱中。
根据白藜芦醇苷和其他成分在硅胶上的亲疏水性差异，通过溶剂梯度洗脱的方法，将白藜芦醇苷从其他杂质中分离出来。
最后，通过溶剂的挥发或其他方法将白藜芦醇苷纯化得到。
还可以利用高效液相色谱（HPLC）等技术进一步提高白藜芦醇苷的纯度。
HPLC是一种基于溶液动力学的色谱技术，可以对复杂样品进行分离和检测。
在HPLC分离过程中，需要选择合适的色谱柱和流动相，通过控制流速和梯度洗脱的方法，将白藜芦醇苷从其他成分中分离出来。
最后，通过检测器对分离得到的白藜芦醇苷进行检测和定量。
虎杖中白藜芦醇苷的提取和分离工艺研究是为了充分利用这一天然药物资源并满足市场需求。
虎杖药理作用研究进展
虎杖药理作用研究进展夏婷婷;杨珺超;刘清源;宋康【期刊名称】《浙江中西医结合杂志》【年(卷),期】2016(026)003【总页数】4页(P294-297)【关键词】虎杖;药理作用;抗纤维化【作者】夏婷婷;杨珺超;刘清源;宋康【作者单位】浙江中医药大学第一临床医学院(杭州 310053);浙江中医药大学附属第一医院呼吸科(杭州 310006);浙江中医药大学第一临床医学院(杭州 310053);浙江中医药大学附属第一医院呼吸科(杭州 310006)【正文语种】中文中药虎杖是蓼科植物，以根和茎入药，其性味微寒微苦，归肝、胆、肺经，能利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰。
虎杖最早出自《名医备录》谓：“主通利月水,破留血癥结”。
《本草纲目》、《滇南本草》、《日华子本草》等本草著作也记载虎杖可用于治疗痈症、慢性支气管炎等各种疾病。
研究表明，虎杖含有多种化学成分，其活性成分主要有大黄素、大黄素甲醚、大黄素8-O-β-D甲酰葡萄糖苷、2-甲氧基-6-乙酰基-甲基胡桃醌、羟基大黄素、（+）-儿茶素、虎杖苷和白藜芦醇等[1]。
目前，虎杖临床主要用于湿热黄疸、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、跌打损伤、肺热咳嗽等病。
药理相关研究表明，虎杖提取物和其主要化合物具有抗感染、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、脂质调节等作用。
肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）作为一种炎症性间质性慢性肺病,其特点表现为肺部炎症引起肺泡持续性损伤及细胞外基质的损坏、重建、修复和沉着。
中医将其归属于“肺痿”、“肺痹”、“短气”、“络病”等范畴，认为其病理关键是痰、瘀、毒[2]。
《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治》云：“热在上焦者，因咳为肺痿。
”基于此，宋康教授等提出热毒为PF发病的始动因素,“清热解毒,正本澄源”为其治疗大法[3]。
临床上宋康教授的经验方及益肺化纤方、肺痿方、虎芪活血煎等时方验方[4-5]中均重用虎杖以清热解毒、化痰散瘀治疗PF。
虎杖提取物的制备及含量测定研究
虎杖提取物的制备及含量测定研究欧水平;任丽;王森;陈灵;王玉和【摘要】目的制备虎杖提取物,并进行含量测定.方法虎杖药材适当粉碎后用95%乙醇回流提取2次,每次2h,合并提取液,减压回收乙醇至无醇味,用乙酸乙酯进行萃取,减压回收乙酸乙酯得二苯乙烯类;水层酸水解后经乙醚索氏提取至无色,乙醚层经5%氢氧化钠溶液萃取,酸化后得到蒽醌类;将二苯乙烯类与蒽醌类混合得到虎杖提取物,采用高效液相色谱(HPLC)法测定虎杖提取物中二苯乙烯类和蒽醌类的含量.结果虎杖提取物得率为9.58%,经高效液相色谱法检测二苯乙烯类(虎杖苷和白藜芦醇)含量为24.34%,蒽醌类(大黄素和大黄素甲醚)含量为39.54%,虎杖提取物主要有效成分含量总和为63.88%.结论该研究可为虎杖药材的开发利用提供依据.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2017(036)010【总页数】5页(P567-570,608)【关键词】虎杖提取物;二苯乙烯;蒽醌;含量测定【作者】欧水平;任丽;王森;陈灵;王玉和【作者单位】遵义医学院附属医院,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院,贵州遵义563000;遵义医学院,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院,贵州遵义563000;遵义医学院附属医院,贵州遵义563000【正文语种】中文【中图分类】R284中药虎杖味微苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀的功效，主要用于关节痹痛、湿热黄疸、痈肿疮毒等，本课题组前期研究结果[1]也表明虎杖提取物口服治疗大鼠痛风性关节炎的疗效确切，其有效部位主要为二苯乙烯类和蒽醌类，其中二苯乙烯类成分白藜芦醇及虎杖苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝聚等作用[2－3]，蒽醌类大黄素及大黄素甲醚具有抗炎、抗肿瘤、保肝等作用[4－5]，故从虎杖药材中尽可能多地提取出二苯乙烯及蒽醌类成分是非常有必要的，且目前有关虎杖有效部位同时提取文献报道较少，故本文通过同时提取分离制备虎杖的二苯乙烯类和蒽醌类成分，以虎杖苷、白藜芦醇为二苯乙烯类的指标成分，以大黄素、大黄素甲醚为蒽醌类的指标成分，采用高效液相色谱(HPLC)法分别测定二苯乙烯类及蒽醌类的有效成分的含量，进而得到整个虎杖提取物中有效成分的含量，为后续虎杖提取物的新药开发利用研究奠定基础。
虎杖
虎杖中药用成分的提取与应用研究一、虎杖基本特征虎杖最早见于《尔雅》。
又有大虫杖（《药性论》），苦杖（《本草拾遗》），酸杖、斑杖（《日华子》），苦杖根、杜牛膝（《本事方》），酸桶笋（《救荒本草》）等名称蓼个属Polygonum L.为蓼科Polygonaceae的一属,本属多为草本。
节常庞大。
单叶互生，托叶鞘多筒状，膜质或上部由草质环边。
花瓣常5裂，花瓣状；雌蕊3-9，通常8枚；花柱2-3。
瘦果三棱形或两面突起。
虎杖的别名有花斑竹、酸筒杆、酸汤梗、川筋龙、斑庄、斑杖根、阴阳莲、大叶蛇总管、黄地榆等。
为多年生粗壮草本，高1.5-3米。
地下有木质、长的根状茎，外皮黑棕色或棕黄色，折断面黄红色。
茎直立，圆柱形，中空，有凸起的纵棱，无毛，散生红色或紫红色斑点。
单叶互生，具短柄；叶阔卵形；圆锥花序；花单性异株，托叶鞘短筒状，膜质，早落。
夏季开绿白色或红色小花，雌雄异株，圆锥花序顶生或腋生；花梗细长，中部有关节，上端有翅；花被5深裂，裂片2轮，外轮3片在果时增大，背部生翅；雄花雄蕊8，雌花花柱3。
瘦果卵形，具三棱，红棕色或黑棕色，平滑光亮，全部包于扩大而成翅状的花被内。
药材虎杖多为圆柱形短段或不规则厚片，长1～7cm，直径0.5～2.5cm。
外皮棕药材虎杖褐色，有纵皱纹及须根痕，切面皮部较薄，木部宽广，棕黄色，射线放射状，皮部与木部较易分离。
根茎髓中有隔或呈空洞状。
质坚硬。
气微，味微苦、涩。
虎杖分布于我国中部及南部。
药材虎杖产于江苏、浙江、福建、山东、河南、陕西、湖北、云南、四川、贵州等地。
野生虎杖多生于山谷、溪旁或岸边。
喜欢暖湿环境，北方地区栽培可以在田间越冬。
对土壤要求不严，而以肥沃的土壤生长为好。
常用种子或分根繁殖。
根部于春、秋二季采挖，除去根须，洗净，趁鲜切短段或厚片，晒干。
二、化学成分近年来国内外学者针对单味中药虎杖的活性成分、药理作用及其提取分离方法开展了大量的实验研究工作和临床应用观察。
虎杖植物的化学成分研究已较为深入，迄今已从虎杖植物中分离得到的化学成分主要有蒽醌类、茋类、酚类、黄酮类。
虎杖苷结构式
虎杖苷结构式虎杖苷结构式：虎杖苷（Rutin）是一种黄酮类化合物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等作用。
其结构式为C27H30O16，化学名称为3-[[6-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-beta-D-glucopyranosyl]oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one。
虎杖苷的生物活性1.抗氧化作用虎杖苷具有较强的抗氧化能力，可以清除自由基，降低氧化应激对生物体的损害。
因此，虎杖苷被广泛应用于食品和药物中，具有较好的保健作用。
2.抗炎作用虎杖苷可以抑制炎症反应，减少炎症介质的释放。
因此，虎杖苷对于预防和治疗炎症等疾病具有重要的作用。
3.抗血栓作用虎杖苷可以促进血管内皮细胞的健康，减少凝血物质的生成，从而减少血栓的形成。
因此，虎杖苷可以预防和治疗心血管疾病，如冠心病、高血压等。
4.抗肿瘤作用虎杖苷可以抑制肿瘤细胞的生长和扩散，促进肿瘤细胞的凋亡和自毁。
因此，虎杖苷被广泛应用于肿瘤治疗中，对于预防和治疗多种类型的肿瘤疾病具有重要的作用。
虎杖苷的应用1.食品添加剂虎杖苷可以作为一种天然色素和保健食品添加剂，广泛应用于果汁、甜点、保健品等。
2.药物虎杖苷可以作为一种抗氧化剂、抗炎剂和抗肿瘤药物，广泛应用于心血管疾病、炎症、肿瘤等疾病的预防和治疗中。
3.化妆品虎杖苷可以作为一种天然保湿剂和抗氧化剂，广泛应用于化妆品中，具有较好的保湿和抗衰老作用。
虎杖苷的副作用和安全性虎杖苷的毒性较低，安全性较高，在大剂量下也很少出现明显的副作用。
但是，对于孕妇、哺乳期妇女、儿童等特殊人群，应该遵医嘱使用，或者在专业人士指导下使用。
虎杖分离实验报告
一、实验目的1. 掌握虎杖的分离技术。
2. 学习并掌握利用色谱法对虎杖中的有效成分进行分离纯化的方法。
3. 了解虎杖有效成分的性质及其应用。
二、实验原理虎杖（Polygonum cuspidatum），又称活血丹、红芽大戟等，为蓼科虎杖属植物。
虎杖中含有多种有效成分，如白藜芦醇、虎杖苷、虎杖酸等，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。
本实验采用色谱法对虎杖进行分离，以提取其中的有效成分。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：虎杖药材、甲醇、正己烷、氯仿、硅胶、薄层色谱板、大孔树脂等。
2. 实验仪器：色谱柱、高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、真空泵、恒温水浴锅、超声波清洗器、电子天平等。
四、实验方法1. 虎杖药材的提取（1）将虎杖药材粉碎，过40目筛，备用。
（2）取5g虎杖药材，加入50ml甲醇，超声提取30min，过滤，滤液备用。
2. 虎杖总提取物分离（1）将滤液减压浓缩至约5ml，加入适量的正己烷，摇匀，静置分层。
（2）取下层正己烷相，加入适量的氯仿，摇匀，静置分层。
（3）取下层氯仿相，减压浓缩至干，得虎杖总提取物。
3. 虎杖总提取物分离纯化（1）将虎杖总提取物用大孔树脂进行吸附，以甲醇为洗脱剂，收集洗脱液。
（2）将洗脱液减压浓缩至干，得虎杖有效成分。
4. 虎杖有效成分的鉴定（1）采用高效液相色谱法对虎杖有效成分进行鉴定。
（2）以甲醇为流动相，检测波长为280nm，流速为1ml/min，柱温为30℃。
五、实验结果与分析1. 虎杖药材的提取实验中，超声提取30min后，虎杖药材的提取率较高，可达90%以上。
2. 虎杖总提取物分离通过正己烷和氯仿的萃取，可得到虎杖总提取物，其得率约为30%。
3. 虎杖总提取物分离纯化通过大孔树脂的吸附和洗脱，可得到虎杖有效成分，其得率约为10%。
4. 虎杖有效成分的鉴定通过高效液相色谱法对虎杖有效成分进行鉴定，结果显示，分离得到的物质与标准品具有相同的保留时间和峰面积，表明分离得到的物质为虎杖有效成分。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究摘要:从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株T-34,利用该菌株产生的B-葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.虎杖的液体发酵动力学研究结果显示:根霉菌T-34能够直接利用虎杖煮提液中的碳源、氮源等作为其生长所需的营养,并且产生的B-葡萄糖苷酶与底物虎杖苷的转化具有相对应的关系,用HPLC测得虎杖苷的转化率达98%.关键词:微生物转化;虎杖;虎杖苷;白藜芦醇;B-葡萄糖苷酶Biotransformation of polydatin fromPolygonum cuspidatumbyRhizopussp. T-34Abstract:, isolated by strain-screening test, could transform polydatin into resveratrolduring fermentation ofPolygonum cuspidatumin this experiment. Kinetics of fermentation was studied tofollow the transformation process, and the results suggested could utilize carbon re-source, nitrogen resource and etc directly as its nutrition, furthermore,B-glucosidase produced by the strainwas correspondingly related to the transformation of polydatin, and the transformation rate of polydatin couldreach 98%.Key words:microbial transformation,Polygonum cuspidatum,polydatin, resveratrol,B-glucosidase1 引言虎杖始载于5名医别录6,为蓼科植物虎杖的干燥根茎,主要有效成分为二苯乙烯类和蒽醌类化合物,前者包括白藜芦醇及其糖苷[1].据报道白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用,白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一[2].干燥虎杖根茎中白藜芦醇含量仅为%~% ,而虎杖苷含量约为2%左右[3],虎杖苷可在肠道中被糖苷酶分解释放出白藜芦醇,发挥其药理作用[4].目前有研究用酸水解法对虎杖苷进行分解[5],但是酸碱会造成环境污染,降低产量,因此不宜用化学法进行水解.也有用改性纤维素酶直接对虎杖苷进行分解[6],但成本较高、工艺较为复杂,不利于推广应用.本项研究采用微生物发酵法转化虎杖苷,即没有强烈的酸碱反应发生,又无需粗提苷,有效的避免了上述两种方法存在的缺陷.因此利用专一微生物进行发酵是提高虎杖中白藜芦醇含量的有效2008年4月第45卷第2期四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition) Apr. 2008途径之一.2 材料和方法材料2.1.1 仪器和试剂虎杖购于成都同仁堂药房,并经成都中医药大学药用植物鉴定室鉴定为蓼科植物虎杖的根茎.白藜芦醇标准品(购于成都思科华有限责任公司),高效液相色谱仪(美国Waters公司),Tu-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),GBRT全自控10L发酵罐(烟台高新区海洋生物工程研究所).2.1.2 培养基初筛平板:主要成分为%NaNO3, 0. 1% K2HPO4, 0. 05% KCl, 0. 05%MgSO4, % FeSO4, 1%虎杖苷.发酵培养基(复筛培养基):主要成分为虎杖煮提液.方法2.2.1 菌种的筛选取自然长菌的虎杖粉1 g,加入20 mL的无菌水,摇匀,静置片刻,取上清液mL梯度稀释,各吸取 mL于初筛平板上按常规涂布方法30e培养3~4 d,挑选长势良好的单菌落,得到青霉,黄曲霉,木霉,根霉等四十株菌种,保藏待用.将初筛菌种接入复筛培养基中,32e,170 r/min摇床中发酵3 和HPLC法检测发酵产物.2.2.2 TLC检测法见文献[7] .2.2.3 HPLC检测法高效液相色谱仪测定白藜芦醇和虎杖苷的色谱分析条件:色谱柱C18柱(416@150 mm);柱温25e;流动相是甲醇:水为40B60;流速1 mL/min,进样量20LL;检测波长305 nm.根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线,白藜芦醇的回归方程为y=@108x+1121@104,相关系数R=,在20@10-6g/mL~100@10-6g/mL范围内和峰面积成线性关系;虎杖苷的回归方程为y=@105,相关系数R=,在20@10-6g/mL~100@10-6g/mL范围内和峰面积成线性关系.2.2.4 发酵动力学研究采用GBRT全自控发酵罐10 L进行发酵罐培养,发酵罐装培养液量为8 L,接种量为5%,孢子悬液浓度为?@108cfu/mL,发酵温度为32e,转速为300 r/min,通气量为0.06 m3/h,初始pH为,发酵周期132 h.发酵动力学的研究内容包括了菌体生长量,碳源,氮源,酶活,pH,苷和苷元变化.菌体生长量的测定方法采取细胞干重法;多糖的测定方法用苯酚硫酸法进行测定;还原糖的测定法是用DNS法进行测定;总蛋白的测定方法是凯氏定氮法;用PNPG作底物进行B-葡萄糖苷酶酶活的测定[8];溶氧采用GBPT全自控发酵罐溶氧测定仪测定;发酵罐在线检测pH值;苷和苷元的检测方法如21213所述.3 结果与分析菌种的筛选将初筛保存的40株菌种分别接种虎杖煮提液(复筛培养基),32e,170 r/min摇床中发酵3 d,发酵液作产物TLC检测,结果如下.表1 转化虎杖苷的菌种筛选Screen microorganisms for biotransformationof polydatin菌种虎杖苷白藜芦醇空白对照CK + -青霉Penicillium chrysogenum+ +黄曲霉Aspergillus flavus+ -黑曲霉Aspergillus niger+ +木霉Trichodermasp - -根霉T-7Rhizopussp T-7 + -根霉T-13Rhizopussp T-13 + +根霉T-16Rhizopussp T-16 + +根霉T-26Rhizopussp T-26 + +根霉T-34Rhizopussp T-34 - +根霉T-38Rhizopussp T-38 + ++: TLC上检测到明显的物质;-: TLC上未检测到明显的物质由表1结果可以看出,其中根霉T-34菌种的虎杖发酵液的TLC结果表明虎杖苷斑点完全消失,白藜芦醇斑点加深明显,此菌株即为目标菌株,该菌株与虎杖共发酵能成功将虎杖苷转化为白藜芦醇.发酵产物的HPLC检测在所述发酵条件下进行液体发酵,并采用HPLC法对发酵转化产物进一步检测.图1为虎杖苷转化产物的HPLC检测结果.对比色谱图Ñ,Ò,可以看出保留时间 min虎杖苷的吸收峰完全消失,保留时间 min白藜芦醇的吸收峰增加明显,这充分证明了该根霉菌与虎杖的共发酵达到了完全转化虎杖苷的目的,生成了目标物白藜芦醇.438四川大学学报(自然科学版)第45卷图1 虎杖苷转化产物的HPLC分析 HPLC analysis of transformation product of PolydatinÑ发酵前的虎杖提取液(10 g/L);Ò发酵后的虎杖提取液(10 g/L )发酵动力学的研究在2.2.4的发酵罐培养条件下进行发酵,每隔一段时间取样,研究发酵过程中菌体量、总糖(多糖和还原糖)、总蛋白、苷和苷元、酶活、溶解氧、pH的变化.进一步揭示了根霉T-34转化虎杖苷的发酵机理,也为该菌种的实际应用提供了参考数据:产物白藜芦醇的积累与酶活密切相关,与菌体生长直接偶联;菌体生长过程中消耗了大量的碳氮源,36h菌体生长进入稳定期,虎杖苷转化为白藜芦醇也在36 h基本完成.这预示着生产过程中若要连续培养,36 h是最佳的补料时间.3.3.1 菌体的生长动力学由图2可知:在整个发酵周期中,碳氮比例变化范围为~,此碳氮比例能满足根霉菌种的生长.在36 h前,总糖(还原糖和多糖)和总蛋白都迅速降低,为菌体的大量生成提供丰富的碳源和氮源.36 h后随着菌体量达到最大,碳源和氮源的消耗速度大幅度的减缓;其中还原糖有缓慢增加的趋势,可能的原因是稳定期中微生物产生了多种酶类如糖化酶、纤维素酶等,这些酶水解淀粉、纤维素等又产生了少量还原糖.3.3.2 菌体量、pH和溶解氧的动力学曲线由图3可知:发酵过程中随着菌体量的增加,溶液的pH由下降到,可能的原因是根霉菌生长能够利用碳源产生了少量有机酸;36 h以后pH变化趋于平缓,92 h后又有所下降;发酵过程中,溶解氧由100%下降到80%,是由于发酵罐中高速的搅拌速度和较高的通风量使溶氧量维持在较高水平.图2 菌体量,还原糖,多糖以及总蛋白的动力学曲线Kinetic curves of biomass, reducing sugar,amylase and total protein3.3.3 酶和底物、产物的动力学曲线由图4可知:24 h前虎杖苷和白藜芦醇的变化不明显,24~36 h,由于B-葡萄糖苷酶的水解作用,虎杖苷由0153 g/L迅速降低直至转化完全,白藜芦醇由0104 g/L迅速增加到最大量0.332 g/L,36 h以后白藜芦醇的量逐步减少.从酶活曲线可见,B-葡萄糖苷酶酶活从12 h开始增加,36 h酶活基本达最大值 U/mL,36 h后酶活缓慢降低.由此可见酶活的变化趋势和底物虎杖苷的转化是相对应的.另外要指出的是白藜芦醇的分子量228,虎杖苷分子量408,根据该图中虎杖苷的最大量和白藜芦醇的增加量计算出虎杖苷转化为白藜芦醇的转化率可达98%.439第2期田天丽等:虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究图3 菌体量、pH和溶解氧的动力学曲线Kinetic curves of biomass, pH valueand dissolved oxygen图4 虎杖苷,白藜芦醇以及B-葡萄糖苷酶酶活的动力学曲线Kinetic curves of polydatin , resveratrol,andB-glucosidase activity4 讨论微生物有着非常强大的分解转化物质的能力,并能产生丰富的酶系,这些丰富而强大的酶系就可能成为中药化学成分在较温和的条件下催化化学反应的物质基础,也就是微生物可以用来发酵转化中药的理论根据[9].本文在此理论基础上对中药虎杖进行微生物的发酵转化,培养基直接采用中药虎杖,不需添加其他成分,发酵条件易控制,且虎杖苷成分转化效率高.通过微生物发酵转化虎杖,一方面提高虎杖中苷元含量,可获得高产苷元提取物;另一方面,有利于中药材虎杖资源的开发和利用.本文建立筛菌模型,对转化虎杖的B-葡萄糖苷酶产生菌进行筛选,具有特异性高,快速简便的优点,筛选到的一株具有转化虎杖中虎杖苷的根霉菌种T-34.通过对发酵产物的TLC、HPLC分析,证实了这株菌种能够转化虎杖苷,并且转化效率达98%以上,从而将虎杖中白藜芦醇含量提高到相当水平.通过研究发酵罐条件下微生物转化虎杖的发酵动力学,证明了该根霉菌能直接利用中药中的碳氮源生长,产生的B-葡萄糖苷酶也能高效水解虎杖苷为白藜芦醇;有关发酵动力学研究所阐述的多种因素的变化和目标产物的变化,提示我们可以通过对培养条件进一步优化,缩短发酵时间使酶活能够更快的达到最高,使得培养条件更加适合虎杖苷的转化,更好的引导实际的中试发酵和生产.参考文献:[1] 刘树兴,程丽英.虎杖有效成分开发现状及展望[J].食品科技, 2005(2): 96.[2] 曹庸,于华忠,张敏,等. HPLC法测定虎杖白藜芦醇的含量及其稳定性研究[J].林产化学与工业,2004, 6(2): 61.[3] Zhao R Z, Liu S J, Zhou L L,et al. Rapid quantita- tive HPTLC analysis, on one plate, of emodin, resvera- trol, and polydatin in the chinese herb Polygonum cusp- idatum[J]. Chromatographia, 2005, 61(5-6): 311.[4] 牛培勤,郭传勇.白藜芦醇药理作用的研究进展[J].医药导报, 2006, 6(6): 524.[5] Rommel A, Wrolstad R E. Influence of acid and base hydrolysis on the phenolic composition of red raspberry juice[J]. J Agr Food Chem A, 1993, 41: 1237.[6] 向海艳,周春山,陈龙胜,等.酶法提取虎杖中白藜芦醇新工艺研究[J].林产化学与工业, 2004, 24(4): 77.[7] 周国海,于华忠,李国章,等. TLC法测定虎杖中白藜芦醇的含量[J].湖南林业科技, 2005, 32(3): 11.[8] Kuo L C, Cheng W Y, Wu R Y,et al. Hydrolysis of black soybean isoflavone glycosides by Bacillus subtilis natto[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 1: 1007. [9] 左风,严梅桢,周钟鸣.肠道菌群对中药有效成分代谢作用的研究进展[J].中国中药杂志, 2002, 27(8):568.[责任编辑:白林含]440四川大学学报(自然科学版)第45卷。