Folin—Ciocalteu法测定浓缩还原橙汁中总酚含量

Folin—Ciocalteu法测定浓缩还原橙汁中总酚含量作者：牛灿杰陈小珍张慧莫卫民王展华吴雨来源：《江苏农业科学》2015年第04期摘要：研究福林-酚（Folin-Ciocaileu）法测定浓缩还原橙汁（refrigerated orange juice from concentrated，ROJFC）中总酚含量的最佳反应条件，比较不同产地商品100%浓缩还原橙汁中的总酚含量。

结果表明：福林试剂的浓度为 0.25 mol/L、Na2CO3的质量分数为12.5%、反应时间为20 min、反应温度为60 ℃时，在0～12 μg/mL范围内，浓缩还原橙汁中多酚含量与其对应的吸光度有良好线性关系（r2=0.998 9），该方法重现性好、精密度高（RSD<2.0%），回收率范围为99.3%～102.3%;不同产地商品浓缩还原橙汁总酚含量差异较大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。

研究结果为进一步研究浓缩还原橙汁的饮用价值提供了技术支持与数据参考。

关键词：浓缩还原橙汁;福林（Folin-Ciocaileu）法;总酚含量;反应条件中图分类号： TS275.5 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）04-0291-03收稿日期：2014-06-05基金项目：国家科技部质检公益性行业科研专项（编号：201310150）。

作者简介：牛灿杰（1988—），女，河南平顶山人，硕士研究生，研究方向为食品安全与检测。

E-mail：ncjlxx@。

通信作者：陈小珍，教授级高级工程师，研究方向为食品安全与检测。

E-mail：cxz730@。

随着人们生活水平的提高，果汁的需求量及消费量逐年增长，橙汁则因其口感好、营养丰富等特点成为国际市场上消费量最大的果汁之一。

目前，市场上销售的橙汁主要有浓缩还原橙汁（from concentrated juice，FC）和鲜榨汁（not from contrated juice，NFC），浓缩还原橙汁因其贮存期长、运输方便、调配简单、成本低等优点占世界橙汁销量的75%[1]。

浓缩还原橙汁中富含许多对人体有益的组分，如氨基酸、糖、维生素C、微量元素、多酚等，其中多酚类物质具有较高的抗氧化活性，可清除自由基，预防疾病[2-4]，且与橙汁混浊密切相关，直接影响橙汁的口感及色泽[5]，因此，浓缩还原橙汁中多酚含量的研究具有重要意义。

目前总酚含量的测量方法有化学发光反应法[6]、2，2-联苯-1-三硝基苯肼（DPPH）测定法[7]、福林（Folin-Ciocalteu）法、FRAP法（Fe3+还原法）[8]、液相色谱法[9-10]等，其中Folin-Ciocalteu法具有操作方便、所用试剂价格低廉、适用于批量检测等优点。

但是目前没有采用Folin-Ciocalteu 法测定浓缩还原橙汁中多酚含量的标准方法，相应研究报道也较少，本研究旨在优化该法的反应条件并将其用于测定不同地区浓缩还原橙汁中的总酚含量。

1 材料与方法1.1 材料与仪器市场购买的不同橙汁主产地[11]的浓缩还原橙汁（商品标签标注产地分别为巴西、美国、以色列、江西省、四川省、浙江省、天津市、河南省、山东省、广东省，均标明果汁含量≥100%），储存于-4 ℃备用;没食子酸标准品，国药集团化学试剂有限公司;福林试剂，上海荔达生物科技有限公司;牛血清蛋白质标样，赛默飞世尔科技有限公司;TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;ABBE-3L折光仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试验方法1.2.1 浓缩还原橙汁果汁含量的测定按GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》测定购买的橙汁果汁含量。

结果表明，浓缩还原橙汁的果汁含量测定值与标签标注值相符。

1.2.2 比色条件的选择配制一系列浓度梯度（0.10、015、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林试剂及质量分数梯度（7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液。

吸取0.5 mL巴西产浓缩还原橙汁至50 mL比色管中，加入25 mL蒸馏水，摇匀，再加入5 mL一定浓度的福林试剂、10 mL一定质量分数的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至50 mL，分别在一定温度梯度（20、40、60 ℃）下反应，测定不同反应时间（10、20、40、60、80 min）下在760 nm处的吸光度。

1.2.3 福林试剂最优浓度的选择取巴西产浓缩还原橙汁0.5 mL，Na2CO3溶液的质量分数为12.5%，恒温水浴温度为60 ℃，反应时间20 min，取 5 mL不同浓度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林试剂，按“1.2.2”节的试验方法，测定体系在760nm处的吸光度。

1.2.4 Na2CO3溶液质量浓度的选择取巴西产浓缩还原橙汁0.5mL，福林试剂的浓度为0.25 mol/L，恒温水浴温度为 60 ℃，反应时间20 min，取10 mL不同质量分数（7.5%、100%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液，按“122”节的试验方法，测定体系在760nm处的吸光度。

1.2.5 反应时间、反应温度的选择取巴西产浓缩还原橙汁0.5 mL，福林试剂的浓度为0.25 mol/L，Na2CO3溶液的质量分数为12.5%，改变温度梯度及反应时间，在760nm处测定吸光度。

1.2.6 标准曲线的建立分别准确移取0、1、2、3、4、5、6 mL浓度为100 μg/mL的没食子酸标准溶液于50 mL比色管中，制得浓度分别为0、2、4、6、8、10、12 μg/mL的系列标准溶液，各加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林试剂，充分摇匀后，各加入10 mL 12.5%的碳酸钠溶液，定容，60 ℃水浴 20 min，760 nm波长下比色，以总酚含量（以没食子酸计）为横坐标、吸光度（D760 nm）为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.7 精密度试验室温条件下，准确移取6份3.0 mL没食子酸标准溶液，按照“1.2.2”节的方法测定总酚含量，计算RSD值。

1.2.8 稳定性试验室温条件下，取同一浓缩还原橙汁 0.5 mL 至50 mL比色管中，加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林试剂、10 mL 12.5%碳酸钠溶液，混合均匀后定容至50 mL，60 ℃水浴20 min，分别在反应时间为30、60、90、120、150、180 min时于760 nm处测定其对应总酚含量，并计算RSD值。

1.2.9 加标回收率试验室温下取0.5 mL巴西产浓缩还原橙汁至50 mL比色管中，按照“1.2.2”节的方法测定其总酚含量作为本底量;再分别移取0.5 mL同一浓缩还原橙汁至3个比色管中，各加入0.5、1.0、1.5 mL的100 μg/mL标准溶液后按照“1.2.2”节的方法测定总酚含量，并计算回收率。

1.2.10 样品总酚含量的测定在选择出最优比色条件后，分别准确移取0.5 mL的样品溶液至50 mL比色管中，按“122”节的方法测定不同产地浓缩还原橙汁的总酚含量。

2 结果与分析2.1 比色条件的选择2.1.1 福林试剂最优浓度的选择由图1可得，在0.10～0.40 mol/L内，随福林试剂浓度增大，D760 nm逐渐增大。

在浓度小于0.25 mol/L时D760 nm增加显著;在浓度大于 0.25 mol/L 时，D760 nm变化较小且趋于平衡。

因此，按照“反应灵敏度高、节约试剂”的原则，选择0.25 mol/L的福林试剂。

2.1.2 Na2CO3溶液质量分数的选择由图2可知，碳酸钠溶液的质量分数为7.5%～12.5%范围内，随着碳酸钠浓度的增大，吸光度随着增加;当碳酸钠溶液的质量分数大于125%时，随碳酸钠溶液质量分数的增大，吸光度减小。

因此选用12.5%的碳酸钠溶液。

2.1.3 反应时间、反应温度的选择由图3可得，反应温度为20、40、60 ℃，反应时间分别为60、40、20 min时，D760 nm达到平衡，D760 nm分别为0.613 2、0.612 7、0.617 4。

按照“灵敏度高、反应时间短”的原则，选择反应温度为60 ℃，反应时间为20 min。

2.2 方法学评价2.2.1 标准曲线的建立结果表明，在0～12 μg/mL浓度范围内，没食子酸的含量与D760 nm线性关系良好，回归方程为y=0.069 4x-0.004 3（r2=0.998 9）。

建立标准曲线如图4所示。

2.2.2 精密度试验精密度试验结果表明，总酚吸光度的RSD为1.09%。

2.2.3 稳定性试验不同反应时间下的RSD值为2.02%，表明稳定性好。

2.2.4 加标回收率试验加标回收率试验结果见表1。

表1 加标回收率结果序号本底量（μg）加标量（μg）测定的总量（μg）回收率（%）1 445.14 50 495.29 100.32 444.58 50 493.63 98.13 443.15 50 493.00 99.71～3平均〖5〗99.44 444.49 100 546.99 102.55 442.99 100 545.79 102.86 445.03 100 546.53 101.54～6平均〖5〗102.37 445.55 150 594.65 99.48 446.77 150 596.02 99.59 446.09 150 594.74 99.17～9平均〖5〗99.32.2.5 干扰试验采用福林试剂测定橙汁多酚时，橙汁中的本底蛋白质含量可能会产生干扰，根据相关文献报道，橙汁中蛋白质含量约为82 μg/mL[12]，取0.5 mL 100 μg/mL牛血清蛋白质溶液，按“1.2.2”节方法测得760 nm处的D760 nm为0019;同样条件下，橙汁中总酚的D760 nm大于0.5，因此蛋白质的影响可以忽略。

2.2.6 浓缩还原橙汁中总酚含量的测定由图5可知，不同地区商品浓缩还原橙汁总酚含量相差较大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。

3 结论本研究采用Folin-Ciocalteu法测定浓缩还原橙汁中总酚含量，确定了反应的最佳条件，该方法具有稳定性好、精密度高、操作简便、省时、不受蛋白质的干扰等优点，为浓缩还原橙汁中总酚含量的研究提供技术支持。

对不同产地商品浓缩还原橙汁中总酚含量的测定发现，总酚含量相差很大，为浓缩还原橙汁的饮用价值研究提供了理论依据。

致谢：感谢莫卫民老师及陈小珍老师在论文选题方面给予的指导，张慧博士在论文写作方面给予的意见，以及王展华、裴华2位同事在试验过程中给予的帮助。