浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究

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浓香型白酒窖泥古菌群落结构研究及其系统发育学分析

现代食品科技
ＭｏｄｅｒｎＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．３
浓香型白酒窖泥古菌群落结构研究及其
系统发 பைடு நூலகம்学分析
黄治国，赵斌，卫春会，邓杰，刘燕梅，黄俊，游辉，唐宇梅
呈现上升趋势；不同窖龄窖泥的古菌相似性指数在０．４３￣０．６１之间，３０年与１００年窖泥古菌群落相似性指数达到了０．６１且聚为一类，
与２００年古菌群落相似性指数相比较却分为两类。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ图谱优势条带割胶测序结果显示：他们分属于产甲烷古菌
ＨＵＡＮＧＺｈｉ－ｇｕｏ，ＺＨＡＯＢｉｎ，ＷＥＩＣｈｕｎ－ｈｕｉ，ＤＥＮＧＪｉｅ，ＬＩＵＹａｎ — ｍｅｉ，ＨＵＡＮＧＪｕｎ，ＹＯＵＨｕｉ，ＴＮＧＹｕ — ｍｅｉ
（ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬｉｑｕｏｒＭａｋｉｎｇＢｉｏ — Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｚｉｇｏｎｇ６４３０００，Ｃｈｉｎａ）
（四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡６４３０００）

宜宾多粮浓香型酒厂内细菌多样性及分布的初步研究(Ⅰ)

ｈｄｓｄｓｒｕｉｔｅｅｖｒｍｅｔｗｈｃｒｄｉｉｔｂｔｇｔｌｓｌｅａｅｔｅｗｉｅｔｉｔｂｔｎｉｈｎｉｎｎ，ｉｈｐｏｅａｅｓｅｉｓａｄｔｅｑａｔｙｏａｔｒｎｓｄｓｉｕｉｎｍｉｈｅｃｏｅｙｒｌｔｄｉｏｎｏｈｔｈｈｔｂｉｔｒｏｂ
ｐｅｇａｎｕｈｕｆｖｒｌｕｒｉ— ｉｓＬｚｏ — ａｏｑｏ．ｒｌｉＫｅｒｓｍｉｒｂ；ｌｐｅｇａｎｕｈｕ－ａｏ；ａｔｒ；ｅａａｉｎａａｙｉｙｗｏｄ：ｃｏｅｍｕｔｌ・ｉｓｚｏ－ｖｒｂｃｅａｓｐｒｔ；ｎｌｓｉ－ｒＬｌｆｉｏｓ
周瑞平，陈云宗，代云唐
（四川省宜宾市叙府酒业技术中心，四川宜宾６４０）４００
摘
要：采用改良的ＮＡ培养基分离、筛选，多粮浓香型酒厂内的空气、从曲药、醅、糟窖泥中分离得到８２株细菌，
其中优势细菌２，４株占分离所得细菌总数的２．７。入窖糟醅中细菌种类及数量最多，９２曲药中芽孢细菌最多，可
（ｅｈｉｌｅｔｆｉｕｒｎｕｔｏｔ．ｂｎＳｃｕｎ６４０，ｈｎ）ＴｃｎｃｎｅｏＸｕｕＬｑｏｄｓｙＣ．ｄ，ｉ，ｉａ４００ＣｉａａＣｒｆＩｒＬＹｉｈ
Ａｂｔａｔ８ａｔｒｔａｎｒｓｌｔｄｆｍｉｓａｔｒｆｒｅｔｄｇａｎｎｉｍｕｌｐｅｇａｎｕｈｕｆｖｒｉｔｌｒｅｙｕｅｏｓｒｃ：２ｂｃｅａｓｒｉｓｗｅｅｉｏａｅｏａｒｔｒ，ｅｍｎｅｒｉｓａｄｐｔｄｉｍｕｔｌ— ｉｓＬｚｏ — ａｏｓｉｅｓｂｓｆｉｒ，ｅｎｉｒｌｄｌｉｍｏｉｅｄｆｄＮＡｕｔｒｄｕＡｍｏｇｔｅ２ｔｉｓｗｅｅｄｍｉａｔｔｉｓ２．７％ｏｅｔｔｌｓｌｔｄｂｃｅａＰｔｎｒｅｍｅｔｄｇａｎａｉｃｌｅｍｅｉｍ．ｕｎｍ，４ｓｒｎｒｏｎｎｒｎ，９２ｈａｓａｆｈａｏａｅａｔｒ．ｉｅｔｆｒｎｅｉｓｄｔｏｉｉｙｒｈ

浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构分析

浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构分析邓杰;卫春会;边名鸿;黄治国【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2017(038)008【摘要】用高通量测序技术对浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构进行研究,找出其差异性,并利用古菌群落结构信息对不同窖龄窖泥进行聚类分析,同时分析环境因子对各个窖龄段窖泥古菌的影响.结果表明,窖泥中的古菌群落主要分布于Euryarchaeota(占99％ OTU数目),分布于7个属;窖泥中古菌的多样性与窖龄呈负相关,Methanobacterium和Methanocorpusculum的优势度与窖龄呈正相关,Thermoplasmatales的优势度与窖龄呈负相关;5a窖龄的不同窖池窖泥和100 a窖龄不同窖池窖泥微生物群落相似性较高,30 a窖龄的不同窖池窖泥微生物群落差异性较大,对各窖龄段窖泥中古菌群落影响最大的环境因子各不相同.浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥古菌群落结构差异性明显,这可能是不同窖龄窖池发酵产酒存在差异性的重要原因之一.【总页数】6页(P37-42)【作者】邓杰;卫春会;边名鸿;黄治国【作者单位】四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1【相关文献】1.中国浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落的空间异质性 [J], 刘森;李林光;李可;贾碧洪;钟小廷;车振明;向文良2.浓香型白酒窖泥变质前后古菌群落差异分析 [J], 于春涛;项明;王蕾;许郑林;刘振江3.浓香型白酒窖池细菌与古菌随窖龄变化的特征 [J], 何翠容;吴冬梅;郑佳;吴重德;周荣清4.浓香型白酒窖池窖泥腐植酸波谱特征与窖龄相关性的研究 [J], 彭昱雯;牛美灿;王平;张宿义;易斌;钱志伟;吴重德;黄钧;周荣清5.宋河浓香型白酒不同窖龄窖壁泥与窖底泥真菌菌群结构分析 [J], 王春艳;付博辰;郭书贤;彦培勋;李学思;李慧星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

浓香型白酒酿造过程中微生态群落的研究进展

浓香型白酒酿造过程中微生态群落的研究进展作者：张新红张源崔磊来源：《科技创新导报》2020年第23期摘要：为探索浓香型白酒酿造过程中的微生态群落演替规律，对浓香型白酒酿造过程中的大曲、酒醅和窖泥等三大人工微生态系统中优势微生物种群进行了分析比较研究，结果发现，浓香型白酒酿造微生态系统存在不稳定性、开放性、目的性和可控性的特点，是酒类酿造中最为复杂的人工微生态系统，三大人工微生态系统之间相互协调，相互融合，完成复杂微生物代谢过程，对浓香型大曲酒生产技术的发展具有指导意义，为进一步提高浓香型白酒的质量和稳定性提供参考。

关键词：浓香型白酒微生物微生态群落演替中图分类号：TS262.3 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2020）08（b）-0066-05Abstract： In order to explore the succession of microecological communities in luzhou-flavor liquor brewing process， the dominant microbial populations in daqu， fermented grains and pit mud in three artificial microecosystems were analyzed and compared. The results showed that the micro-ecological communities of brewing of luzhou-flavor liquor charactered with instability， openness，teleonomy and controllability are the most complex artificial micro-ecosystems in liquor brewing. The micro-ecosystems of Daqu， fermented grains and pit mud collectively complete the complex metabolic process of microorganism by coordination and fusion with each other. It has guiding significance to the development of brewing technique of luzhou-flavorliquor ， and which can provide reference for improvement of quality and stability of luzhou-flavorliquor.Key Words： Luzhou-flavorliquor; Microorganism; Micro-ecological; Community succession食品釀造历史悠久，源远流长，产品种类繁多，风味独特，以酒类酿造最具代表。

不同质量窖泥古菌群落的研究

不同质量窖泥古菌群落的研究杜礼泉;唐聪;罗惠波;黄治国;苟云凌;贺新生;王远成;饶家权;王晓刚;范昌明【摘要】采用多聚酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳指纹分析技术（PCR-DGGE）对不同质量窖泥中古菌群落结构进行分析，说明了不同质量窖泥古菌种群的复杂性，再次印证了产甲烷菌是窖泥中古菌的优势菌，并在此基础上揭示了窖泥中产甲烷菌种属上的多样性。

发现了以最优质窖泥为参照，窖泥质量与其古菌群落间的相似性指数总体呈正相关这一规律，为今后研究窖泥培养、养护和应用提供了理论依据。

%In this study, the structures of archaea communities in pit mud of different quality were analyzed by PCR-DGGE. The analytic re-sults proved the complexity of archaea communities in pit mud of different quality. And it also proved that methanogenic bacteria was the domi-nant archaeal inpit mud. Besides, the analytic results revealed the diversity of methanogenic bacteria species. It was found that, with reference to the best pit mud, the quality of pit mud was positively correlated to archaeal community similarity indexes. Those findings provided theoreti-cal evidences for further research on pit mud culture, maintenance and application.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】4页(P58-61)【关键词】微生物;浓香型白酒;窖泥;古菌群落;白酒【作者】杜礼泉;唐聪;罗惠波;黄治国;苟云凌;贺新生;王远成;饶家权;王晓刚;范昌明【作者单位】西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010; 四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000;四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000;四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司，四川绵阳621000【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;TS262.3;TS261.1古菌是一类具有独特的基因结构或系统发育生物大分子序列的单细胞生物，多生活在各种极端的自然环境中，如海洋底部的高压热溢口、热泉、盐碱湖等[1]。

浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析

• 12 •fi‘i g 你2017年11月第32卷第6期JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY Vol. 32 No. 6 Nov. 2017引用格式：曾田，胡晓龙，马兆，等.浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析[】].轻工学报，2017,32(6):12 -19.中图分类号:TS261.1 文献标识码:A DOI ： 10. 3969/j. issn. 2096 - 1553.2017.6.002 文章编号:2096 -1553(2017)06 -0012 -08浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析Analysis of prokaryotic mirobial community diversity with the capability of caproic acid-producing and lactic acid-utilizing in the pit muds of Luzhou-flavor liquor曾田1 ’4，胡晓龙2，马兆2，崔媛媛2，王京京2，何培新2，李聪聪2，牛广杰3，李红1ZENG Tian1'4,!!!! Xiao-long2 , MA Zhao2,CUI Yuan-yuan2 , WANG Jing-jing2 ,HE Pei-xin2 , LI Cong-cong2 , NIU Guang-jie3, LI Hong11. 五粮液集团有限公司，四川宜宾644000;2. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001;3. 河南省百泉春酒业有限公司，河南新乡453000;4. 河南五谷春酒业股份有限公司，河南信阳4640001. Wuliangye Group C o. , Ltd. , Yibin 644000, China ；2. College of Food and Bioengineering, Z hengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450001 , China ；3. He'nan Baiquanchun Wine Co. ,Ltd. ,Xinxiang 453000,China'A. He'nan Wuguchun Wine C o. ,Ltd. ,Xinyang 464000,China摘要：以河南某酒企浓香型白酒窖泥样品中的微生物作为出发菌群，分别构建产己酸菌群和降乳酸菌群.基于原核微生物16S rRNA 基因V 4可变区，分别对上述两种菌群进行高通量测序分析，结果表明，两种菌群中物种多样性均低于窖泥出发菌群，且优势微生物组成发生了明显改变.产己酸菌群的优势菌主要集中在厚壁菌门中的CZorf 属和ftH7w:H.ococcw.,s 属，而降乳酸菌群的优势微支物支要集中在專壁菌的 Bacillus, Clostridium ，Sporaiiaerobacter, Soehiigen.ia,Oscillospira , Ruminococcus , Paenibacillus , Calclicoprobacter , Sedimentibacter, Doreci , Coprococcw-s 和丨:A :nw :C T 〇&w'ml2个属.本研究结果有助于明晰菩泥中与产己酸和降乳酸有关微生物的分类学地位，并为通过定向组装高产己酸群落和有效降乳酸群落、实现浓香型白酒酿造过程中“增己降乳”提供理论支撑.关键词：窖泥微生物；高通量测序；浓香型白酒；群落多样性Key words ：microbe in pit muds; high-throughput sequencing;Luzhou-flavor liquor; community diversity收稿日期:2017 -08 -30基金项目：中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目（2017JJ012);郑州轻工业学院博士科研基金资助项目（2016BSJJ018);郑州轻工业学院研究生科技刨新项目（2016030)作者简介：曾田（1985—），男，重庆市人，五粮液集团有限公司工程师，主要研究方向为白酒酿造.通信作者：胡晓龙（1984—），男，河南省杞县人，郑州轻工业学院讲师，博士，主要研究方向为白酒酿造工程.曾田，等：浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析• 13 •Abstract：The caproic acid-producing and lactic acid-utilizing consortiums were constructed based on microbe in pit muds of Luzhou-flavor liquor from one wine corporation in Hernan. The prokaryotic microbial community was analyzed using high-throughput sequencing based on the V4 variable regions of 16S rRNA gene. The results showed that the species diversities in both constructed consortiums were lower than those in pit muds, which was accompanied by the obvious changes in composition of dominant microbe. The dominant prokaryotes in the caproic acid-producing consortiums were the Firmicute Clostridium and Ruminococcus.The dominant prokaryotes in the lactic acid-utilizing consortiums belonged to the Firmicute Bacillus, Clostridium, Sporanaer-obacter，Soehngenia，Oscillospira, Ruminococcus, Paenibacillus, Caldicoprobacter, Sedimentibacter, Dorea, Coprococcus and Tepidimicrobium.This study will be conducive to clarify the taxonomic status of caproic acid- producing and lactic acid-utilizing consortiums in pit muds, and provide theoretical support for realizing caproic acid-producing and lactic acid-utilizing in production of Luzhou-flavor liquor through microbial directional bioaugmentation.〇引言中國白酒历史悠久、|艺独特，是我国独具民族特色的蒸馏酒，与威i：忌、伏特加、白兰地、朗姆酒和金酒并称为世界六大蒸馏酒™.基于酿造工艺和风格的差异,丨白酒又分为4个基本香型，即浓香型、酱香型、猜香型和米香型.其.中浓香型義酒在中国白酒市场上处于主导地位，其产错量均达7〇%茬右[2—3]•浓香型f t酒的酿造以泥窖为发酵容器，窖泥是浓香型f t酒酿造微生物的主要来源之一，其微生物的组成与多样性是决定窖泥质量优劣的重要因素+A窖泥菌群+分复杂，栖息着成上千种微生物.根据窖泥微生物的功能之不同，可以将其分为己酸菌、醋酸菌、乳酸菌、丁酸菌、酵母菌、酯化菌和硫酸盐还原菌等w.根据微生物分类学，窖泥微生物包括原核微生物中的，厚壁菌门（Firnii- cutes)、广古菌门（Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等33个菌门中的300多个物种&3|以及真核微生物中的子囊菌门（A sco-myeota)、接'合菌门（Zygomycota)、'担乎菌门(Basidiomycota)、壶爾..门.（Cliytri.d iomy.c ota.)中的 m个嵐m.在上述窖泥微生物中，产己酸微生物和降乳酸微生物一宣被认为是浓香型白酒酿造过程中重要的功能微生物类群.其中，产己酸微生物的代谢产物己酸既是白酒中重要的香气物质，也可以作为浓香型白酒主体香气物质己酸乙酯合成的前体M.已酸乙酯含量的高低决定浓香型6酒的品质，根据浓香型白酒国家标准规定s 优级浓香型3酒中已酸乙酯质量浓度应为1.2 ~2. 8 g/L.自I960年代就有a酒工作者针对如何提升浓香型白洒中己酸和己酸乙酯的含量(增己）开展研究，目前发现能产己酸的微生物食要为梭菌属.(:)，如，C.CQcfcaton 和 d w s/m".等[8]•.但臀濕暴.一■个复杂的微生态体系，其中除了含有梭菌属外，是否存在与其协同产己酸的其他种属尚不明晰. 此外，&酒酿造过程中会有大量乳酸形成和积累，这主要与乳杆菌.羼（_)发酵有关^5].大量乳酸积累将导致白酒中乳酸和乳酸乙酯含量增高，使白酒中四大酸（乙酸、乳酸、丁酸和己酸）和四大酯（乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯）的酸/酯比例失衡t9]，A酒呈现明显的酸涩感，从而降低f t酒品质.因此，明晰窖泥中与降乳酸相关的微生物菌群的多样性，将有助于从浓香型白酒生产源头上降低乳酸和乳酸乙酯含釐< 降乳本研究以浓香型酒窖泥微生物为研究对象，构建产B 酸菌群和降乳酸菌群，采用高通量测序技术解• 14 •矜玉§你2〇17年11月第32卷第6期析上述菌群中原核微生物群落组成和多样性，进而明晰窖泥中与产己酸和降乳酸相关的微生物种属信息，为通过定向微生物强化和调整窖泥相应理化性质,进而实现浓香型白酒“增己降乳”提供理论依据.1材料与方法1.1材料1.1.1样品采集本研究所用窖泥样品取自河南某酒企两口正常发酵窖池中的窖底泥样品，分别装入无菌取样袋中并标记为J%和 JN2，置于盛有冰袋的泡沫取样箱运至实验室，放入冰箱于4 °C下保存,用于后续窖泥基因组提取、产己酸菌群和降乳酸菌群的构建.1.1.2主要试剂与仪器酵母粉，购自英国OXOID公司;六水合氯化钴、无水氯化钙，均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司；土壤 D N A提取试剂盒（CW2091),购自北京康为世纪生物科技有限公司；515F/806R引物合成、PCR Master Mix(2X)(K0171)和其余化学试剂,均购自生工生物工程(上海)股份有限公司.安捷伦7820A气相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司产;C1000 Touch™P C R仪，美国Bio-Rad公司产；Illumina MiSeq Benchtop 测序仪，美国Illumina公司产.1.2实验方法1.2.1培养基与溶液配制1.2.1.1产己酸富集培养基（E S)的配制准确称取酵母粉 5. 000 g,NaCl0. 90 g, (NH4)2S04 0. 90 g,MgCl2.6H200. 085 g, CaCl2 • 2H20 0.066 g,MnCl2• 4H20 0. 028 g, FeS04 • 7H20 0.020 g,ZnCl2 0. 009 g,CoCl2•6H200.002 g,KH2P040.01 g,Na2C030.032 g,盐酸半胱胺酸盐〇. 300 g加水溶解，定容至1000 mL,121 °C高压蒸汽灭菌20 min,灭菌结束冷却至室温后加入20 m L无水乙醇.1.2.1.2降解乳酸培养基（YCFAL)的配制[1B]酪蛋白1.000 g,酵母浸出液0.250 g,NaH-C030. 400 g,半胱氨酸0. 100 g,K2HP02 0.045 g,KH2P040. 045 g,NaCl0. 090 g, MgS04.7H20 0.009 g,CaCl2 0.009 g,血红素1mg,生物素1|xg,钴胺素1|xg,对氨基苯甲酸3 |xg,叶酸5 |xg,舭咳胺15 |xg,硫胺素0.05 |xg,核黄素〇.〇5 |xg,刃天青0.1 mg,添加质量分数为0.25%的乳酸作为碳源.准确称取酪蛋白，酵母浸出液,NaHC03，半胱氨酸，K2HP04,KH2P04,NaCl,MgS04• 7H20, CaCl2,加水溶解，随后加入配置好的血红素和热稳定的维生素，调整pH =5. 8〜6.1,将培养基分装到滚管中，并用橡胶塞密封，进行气体抽换,实现厌氧条件,115 °C灭菌20 min,待培养基冷却后,用注射器加入已过滤灭菌的热不稳定的硫胺素和核黄素.1.2.1.3溶液配制质量分数为5%的醋酸铜溶液配制:称取50 g醋酸铜溶于1L去离子水中，搅拌均匀，置于试剂瓶中待用.质量分数为72%的硫酸溶液配制:准确吸取163 m L质量分数为98%的浓硫酸缓缓倒入盛有80 mL去离子水的烧杯中，冷却后用容量瓶定容至250 mL,并置于广口试剂瓶中保存.质量分数为1%的己酸溶液配制：准确吸取1075 |j l L的己酸，加入100 m L的容量瓶中，再用体积分数20%的乙醇溶液定容至100 mL.1.2.2产己酸菌群和降乳酸菌群构建1.2.2. 1 窖泥菌悬液制备称取窖泥样品JN!和JN2各5 g,分别置于盛有45 m L无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡均匀，以备后续窖泥产己酸菌群和降乳酸菌群实验使用.1.2.2.2产己酸菌群构建分别吸取窖泥样品风和JN2的菌悬液各10 m L置于无菌试管中,80 °C水浴10 min.将热处理后来源不同的窖泥菌悬液按体积分数5%的接种量分别接种曾田，等：浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析• 15 •至100 m L的E S培养基中，置于培养箱中于37 °C下培养5〜8 d.采用醋酸铜显色法初步检测上述发酵液中己酸含量[11]，选取产己酸量最高发酵液中的培养物以体积分数5%的接种量分别接种至1〇〇 m L新E S培养基中，每5〜8 d 将获得的产己酸培养物重新转接1次,连续转接3 —5次，以获得稳定的产己酸菌群.1.2. 2. 3 降乳酸菌群构建吸取窖泥样品J%和JN2的菌悬液，按体积分数5%的接种量分别接种至1〇〇 m L的Y C F A L液体培养基中，置于37 °C培养箱中培养，每2〜3 d将获得的培养物按体积分数5%的接种量转接至100 mL 新YC F A L液体培养基中，连续转接3 —5次，以获得降乳酸能力的稳定菌群.1.2.3发酵液中己酸和乳酸的测定1.2.3.1己酸的测定己酸测定标准曲线制作:分别准确吸取1%己酸溶液〇mL,l mL, 2 mL,4 mL,6 m L至干净的10 m L的容量瓶中，用E S培养基定容为不同浓度梯度的己酸标准溶液，每个浓度梯度设3个平行.己酸标准溶液中己酸的萃取：分别吸取5 mL上述己酸溶液至50 m L干净的离心管中，加入25帅乃％硫酸、20 |xL 2 -乙基丁酸（内标）及10m L乙醚.涡旋振荡10 min,静置10 min.用一次性注射器吸取乙醚层并将其经0. 22 |xm有机滤膜过滤，气相色谱法测定.发酵液中己酸测定:吸取产己酸菌群的发酵液10 mL,10 000 r/m in离心10 min,收集上清液，然后用相同的方法萃取发酵液中的己酸，并用0.22 |xm有机滤膜过滤、气相色谱法测定.气相色谱分析条件如下.J&W DB - WAX 毛细管色谱柱（30 m X 250 |xm X 0.25 |xm),进样口温度200 °C ,检测器温度250 °C ,程序升温条件：起始温度1〇〇°C,保持lm in,以 10 °C/m in升至220 °C ,保持2 min.氢气流速35 m iy min,空气流速400 mL/min,尾吹气流速20 ml/min,进样体积1|x L,分流比20 : 1. 1.2.3.2乳酸的测定发酵液中乳酸测定采用对羟基联苯比色法，具体实验步骤参考高庆等[12]报道的实验方法.1.2.4基因组提取、高通量测序及数据处理基因组提取：吸取一定量的产己酸（或降乳酸或窖泥悬浮液）菌群发酵液，离心弃上清,超纯水洗涤沉淀1次.洗涤后的细胞基因组提取及纯化按照土壤基因组D N A提取试剂盒说明书进行提取.P C R扩增:采用原核微生物通用引物515F/ 806R对上述基因组进行PCR扩增,PCR扩增体系及扩增条件参照Y.D.Nam等[13]的报道.高通量测序分析和数据处理:对上述PCR 扩增产物进行纯化、连接高通量测序接头、构建 DNA文库及高通量测序（Illumina Miseq),分析及数据处理等参照X.H u等[5]报道的方法，其中主成分分析（PCA)方法参照R.Zhang等[14]报道的方法.2结果与讨论2.1产己酸菌群产己酸能力及降乳酸菌群利用乳酸的效率将窖泥样品J%和JN2中出发菌群接种至E S培养基发酵6 d后，己酸产量分别为0.31 g/L和0.39 g/L.产己酸菌群1A和1B分别是窖泥J%和JN2中出发菌群经E S培养基连续富集培养4次后的培养物，其在E S培养基中发酵6 d后，己酸产量分别为4. 39 g/L和4.00 g/L,约为出发菌群己酸产量的10倍.窖泥样品J K和JN2中出发菌群分别接种至Y C F A L培养基发酵3 d后，该培养基中的乳酸含量分别下降18.29%和14. 40%.降乳酸菌群2A和2B分别是窖泥样品机和JN2中出发菌群经Y C F A L培养基连续富集培养5次后的培养物，其在Y C F A L培养基发酵3 d后,培养基• 16 •矜玉§你2〇17年11月第32卷第6期中乳酸含量分别下降60.70%和58. 56%.上述结果表明,构建的产己酸菌群和降乳酸菌群与窖泥出发菌群相比，产己酸能力和利用乳酸能力存在明显差异,表明窖泥出发菌群在构建上述菌群的过程中，其群落组成可能发生了变化.2.2窖泥样品、产己酸菌群和降乳酸菌群中的微生物多样性2.2.1微生物群落a-多样性窖泥样品、产己酸菌群和降乳酸菌群中微生物多样性分析如表1所示.由表1可知，本研究供试窖泥样品微生物群落的多样性指数Chaol,Observed species 和Shannon的平均值分别为1973, 1136和 6.06,表明供试窖泥样品含有复杂的微生物菌群，这与C.D.Wang等[15]研究四川某酒企窖泥微生物群落多样性指数相似.产己酸菌群和降乳酸菌群中原核微生物多样性指数较窖泥微生物群落多样性指数低，尤其是C h a o l和 Observed species,均值分别为521 和385,589 和 449,表明上述两种菌群中物种多样性远低于窖泥微生物物种多样性.这主要是由于富集培养基中的理化因子复杂程度远低于窖泥环境，窖泥中除了含有丰富的碳、氮源、无机盐、生长因子外[4’16]，还存在成百上千种挥发性物质（如脂肪酸、酯类、醇类、醛酮类等）[17]，导致出发菌群中大量微生物在富集过程中被淘汰，而某些种属微生物被富集.2.2.2微生物群落多样性2.2.2.1优势微生物组成窖泥样品、产己酸菌群和降乳酸菌群中优势微生物门组成如图1所示.在门水平上，供试窖泥中优势微生物（相对含量>0. 1% )共11个门（图l a)),其中以厚壁菌门、广古菌门、变形菌门（Proteobacteria)、放线菌门（Actinobacteria)、拟杆菌门5个门为核心微生物门（相对含量> 1%),这与四川和江苏等地域窖泥中的核心微生物门组成一致[4+14].表1窖泥样品、产己酸和降乳酸菌群中的微生物多样性分析Table 1 Microbial community diversity in pit muds,caproic acid-producingand lactic acid-utilizing consortiums多样性指数Chaol Goods coverage Observed Shannon 多丰度指数指数sp ec ies指数样性指数窖泥样品j n219580.951152 6.22j n219870.951120 5.90产己酸菌群1A5360.99386 4.89IB5050.99384 4.79降乳酸菌群2A6610.99485 5.592B5170.99412 4.65产己酸菌群和降乳酸菌群主要为厚壁菌门，含量均达99. 7%以上,这也表明厚壁菌门中某些种属分别与产己酸和利用乳酸的代i射有关.产己酸菌群和降乳酸菌群中优势微生物组成如图2所示，在纲水平上（图2a)和c)),产己酸菌群中优势微生物主要为梭菌纲（Clostridia),含量达99.7%;降乳酸菌群中优势微生物主要为梭菌纲和雜杆菌纲(Bacilli),含量达99.5%.在属水平上,产己酸菌群中优势微生物主要为梭菌纲中的梭菌属（)及瘤胃球菌属,含量达75. 7% (图 2c)),表明这两类微生物与窖泥出发菌群产己酸能力有关.目前已报道的产己酸微生物主要集中在C/osfr紐属，如 C_,C_RS - 1 和 C_ ce/erecracms等[18^19]，而未见瘤胃球菌属中的物种产己酸的报道，但该属中的一些物种能利用多种糖类或H2/C02产乙酸和乙醇等代谢物，如 R.champanettensis, R.flavefaciens, R.al-6似,i?_,i?_/laTiseW 等[2°-21].其中乙酸和乙醇为产己酸梭菌（如C.合成己酸的主要底物[22]，同时解除H2的环境胁迫有利于提高己酸产量[4].降乳酸菌群优势微生物共12 个属，其中核心属为及^〖//似，67〇你〖<^?71,5^〇- ranaerobacter, Soehngenia, Oscillospira Rumino-cocciw,含量达76. 15% (图2d)).栗连会[23]报曾田，等::浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析• 17 •Euryarchaeota( 13.7%)Proteobacteria(2.8%)Actinobacteria(1.3%)■Bacteroidetes(1.2%)Chloroflexi(0.5%)Crenarchaeota(0.5%)Acidobacteria(0.4°/〇)^nergistetes(0.2%)itrospirae(0.1%)./ Gemmatimonadetes(0.1%)a)窖泥样品b)产已酸菌群c)降乳酸菌群图1窖泥样品、产己酸和降乳酸菌群中优势微生物门组成Fig. 1The composition of dominant microbe at phylum level in pit muds,caproic acid-producing and lactic acid-utilizing consortiumsc)产已酸菌群属水平b)降乳酸菌群纲水平Erysipelotrichi(0.3%)UnassignedOthers图2产己酸和降乳酸菌群中优势微生物组成Fig. 2 The composition of dominant microbe in caproic acid-producing and lactic acid-utilizing consortiums道了浓香型白酒酿造环境中的SadZ—和臟等物种具有降乳酸能力，如C.coc/zieah-从爪，乳酸利用率高达94. 1%，而5.ciem乳酸利用率仅为20%左右，这与本文研究结果基本一致.但其他核心属（如^等)降乳酸能力的研究未见报道，其对乳酸直接利用或协同利用乳酸情况仍需进一步研究. 2.2.2.2主成分分析基于害泥样品、产己酸菌群和降乳酸菌群中门和纲水平，对优势微生物进行主成分分析，结果如图3所示.由图3a) 可知，每类菌群能较好地聚在一起，表明每类菌群中优势微生物存在较大差异.从图3b)可知，• 18 •跟2〇17年11月第32卷第6期Firmicutes0 Co Acidobac Bacilli ,1.00.5rs-1.0~1.0因子!(二:;铒子W 一a )聚类分析图~10^〇5—〇〇因子1因子3b )因子载荷图图3窖泥样品、产己酸和降乳酸菌群中优势生物的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) based on the dominant microbe in pit muds,caproic acid-producing and lactic acid-utilizing consortiums在窖泥菌群向产己酸菌群转变的过程中#厚壁菌门中的梭菌纲明显增加，而广古菌门中的甲烷杆菌纲和甲烷微菌纲，以及拟杆菌门中拟杆菌纲明显减少.在窖泥菌群向降乳酸菌群转变的过程中厚壁菌门中的梭菌纲及芽孢杆菌纲含量明显増加，而窖泥菌群中的其他优势门和优势纲原核微生物明显减少.已有研究表明，上述微生物的组成与窖泥的理化性质(p H 值，NH4+，水溶性有机碳，有效磷等)存在显著的相关性，如Clos tridia 纲细菌的含量在一定范围内与 pH 值昼疋相关，而与窖泥中水溶性有机碳的含量呈负相关+5].因此，通过调整窖泥的理化性质进而相应改变窖泥菌群的组成，增强窖泥微亜物菌群产' 已酸或降乳酸代谢能力，进而提高窖泥质量4有利于从微生物源头提升浓香型白酒品质.3结论本研究以河南某酒企正常发酵窖池中的窖泥微生物为出发菌群，分别构建了产己酸菌群和降乳酸菌群，其中.，产E酸菌群在E S 培养基中S 酸产董达4. 2降乳酸菌群对YCFAL培莽_中的乳酸利用率达59. 7% •遲f旗核微生物16SrRNA _因V 4冒:变減的离通量测序解析了上述菌群中微生物群落组成和多样性. 其中，产已酸菌群和降乳酸菌群较窖泥出发菌群的微生物群落多样性降低，且优势微生物均为厚壁菌门•产己酸菌群的优势菌主要集中在，厚鐘菌门中的属和属;而降乳酸菌群的优势菌主要集中在厚壁菌(飞的 Bacillus ,Clostridium.，Sporanaerobacter ,Soe -hngenia ，Oscillospira ，Ruminococcus ，Paenibacil -lus ,Caldicoprobacter ，Sedimentibacter ，Dorea ，Cop -rococcus 和共12个属，这表明上述菌群中的优势微生物在窖泥中能直接或协同参与产己酸或降乳酸的代i t 过程•窖泥产己酸菌群和降乳酸菌群优势微生物的明晰能为定向组装高产已酸群落和有效降乳酸群落提供一定的理论支撑，有助于从酿造源头上实现浓香型白酒的“增己降乳”貧标.参考文献：[1 ]王传荣.白酒的香型及其风味特征研究[.JI.酿酒科技，2008，171(9):49.[2]ZHAO J S,ZHENG J ,ZH 0K R Q,et al . Micro bial community structure of pit mud in a Chinese strong aromatic liquor fermentation pit [ J ].Journal of the Institute of Brewing, 2012,118曾田，等：浓香型白酒窖泥中“增己降乳”原核微生物群落多样性解析• 19 •(4) ：356.[3]韩金宏，励建荣.我国白酒行业的现状和发展前景[J]•农产品加工（学刊），2006,55(2):50. [4] TAO Y,LI J B,RUI J P,et al. Prokaryotic communities in pit mud from different-aged cellarsused for the production of Chinese strong-flavored liquor [ J ]. Applied and EnvironmentalMicrobiology,2014,80(7) ：2254.[5] HU X,DU H,REN C,et al. Illuminating Anaerobic microbial community and cooccurrencepatterns across a quality gradient in Chinese liquor fermentation pit muds [ J ] -Applied andEnvironmental Microbiology,2016,82(8) ：2506. [6] WU Y Y,XUE T R,CHEN Z R,et al. Study ondistribution and action of anaerobic bacteria inWuliangye older fermented-pits[ J].Acta Micro-biologica Sinica,1991,31(4) ；299.[7] LIU M，TANG Y，ZHAO K，et al. 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浓香型有机窖泥的研究

钾为微生物的营养源。
表２无机窖泥与有机窖泥水份及营养成分分析
无机窖泥的主要营养物质是磷酸二铵、尿素、硫酸铵氯化
是高分子复杂化合物及植物残体或其分解产物的一些物
铵、氯化钾等酸『生物质，这些无机营养物在微生物的代谢过程中，产生积累作用，生物在消耗氮、、微磷钾等营养物质后，其硫酸根、氯根等离子浓度相对增大，导致窖泥中Ｈ＋多，增使窖泥迅速酸化，致使窖泥的团粒结构破坏，窖泥的蓄水能力下降，表面出现板结、Ｈ下降的现象（ｐ己酸菌的适宜生长ｐＨ在
提高，特别是使用５年后，无机窖泥中己酸菌和甲烷菌的数量
的下降趋势，窖泥的老化现象开始出现。
１．窖泥感官不同２
主要培养己酸菌，所含的微生物菌群较少，生成香味成分单
一
。
表１是两种窖泥中微生物的种类区别。
表１无机窖泥与有机窖泥微生物分布特征个，干ｇ土
ｐ。同时，Ｈ培养好的窖泥建窖后不易渗漏，能保持黄水的容
量，对提高基酒质量十分有利，因土壤多为砂土，土时北方选若不注意，易导致窖泥渗漏、少黄水或无黄水，从而影响酒质。
２１．．５酒糟
第四期
用发酵正常，未蒸酒的母糟。
２１．．６黄水
酵母细胞的正常功能。将干酵母按１０～２：１０的比例投放于３６—３￣８Ｃ的温水中
要求新鲜、无霉变、无异味、有粘性、酸度小的黄水。黄水中内含有机酸、乙醇、腐殖质、酵母自溶物，以及一些经驯化的生香菌类细菌，己酸菌绝佳的营养物，是将其制成黄水复合液后效果更佳，体做法是：２０ｇ具将０ｋ黄水置入５０ｇ坛中，０ｋ加

白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展

白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展郭壮;赵慧君;雷敏;沈馨;蔡宏宇;张振东【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2018(039)022【摘要】浓香型白酒通常采用固态发酵法,使用泥窖发酵,因此在发酵过程中窖泥中部分微生物进入到白酒糟醅中,在白酒的香型形成中发挥着重要的作用,对窖泥微生物多样性的解析就显得极为重要.由于传统的微生物群落分析方法依赖于纯培养技术,对于多数营养要求苛刻、严格厌氧的微生物分离较为困难,难以获取窖泥中微生物群落多样性更为完整全面的信息.概述常用的传统纯培养方法及克隆文库、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)、变形梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、第二代测序技术、宏基因组技术等不依赖于纯培养技术的窖泥微生物多样性研究的技术方法,并简要介绍了将来可能在窖泥微生物研究中得到广泛应用的三代测序技术.【总页数】8页(P200-207)【作者】郭壮;赵慧君;雷敏;沈馨;蔡宏宇;张振东【作者单位】湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053【正文语种】中文【相关文献】1.16S-23S rRNA ITS-AFLP指纹图谱分析在白酒窖泥原核微生物多样性分析中的应用 [J], 邓依;唐云容;张文学2.基于PCR-DGGE技术的古襄阳白酒窖泥微生物多样性分析 [J], 向凡舒; 王瑞萍; 赵慧君; 雷敏; 崔梦君; 李娜; 折米娜; 郭壮; 张振东3.不同研究方法在白酒微生物多样性研究中的应用 [J], 麻颖垚;胡萍;孙利林;田亚4.泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展 [J], 张宿义;刘淼;沈才洪;林锋;罗惠波;侯长军;熊燕飞;杨艳;李德林5.浓香型白酒窖泥中产己酸菌的研究进展 [J], 唐伟斌;王海丽;宫彬彬;李林;王子权;王梦娇;钱含微;姚亚辉;许长峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究
浓香型白酒窖泥中栖息着大量可培养及不可培养的微生物,而这些微生物群落组成及多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。

此外,专性厌氧梭菌纲微生物及产己酸微生物一直被认为是窖泥中的重要功能菌群。

然而,关于窖泥质量与微生物群落之间的关联性及上述功能微生物群落多样性解析的系统研究尚无报道。

因此,全面剖析窖泥中功能微生物菌群组成及多样性、窖泥质量与微生物群落之间的关联性为深入认识浓香型白酒生产机制,进而为从根本上提升浓香型白酒品质提供理论依据。

同时也是带动浓香型白酒传统生产技术升级及实现浓香型白酒可持续发展的必要环节。

本课题以浓香型白酒窖泥为研究对象,围绕目前微生物学研究的核心问题——微生物群落组成及多样性解析、微生物之间相关性和功能微生物确定开展相关研究。

采用了传统可培养技术及多种分子生态学技术并建立和开发了相应的新方法及策略,定性及定量研究了窖泥中功能微生物菌群组成及不同质量等级窖泥样品中微生物群落组成。

合理运用了多种生物信息学方法,揭示了窖泥质量与微生物群落之间、理化因子与微生物群落之间、微生物群落成员之间的相关性。

本论文主要研究结果如下:(1)针对16S r RNA基因V4可变区,采用Illumina Miseq高通量测序技术对不同质量窖泥样品中原核微生物群落多样性进行解析。

在不同分类水平中共检测到33个门、145个目及225个属的原核微生物。

微生物群落α-多样性分析结果表明,微生物群落的Shannon多样性指数及Chao1丰度指数随着窖泥质量提高呈现显著增加趋势。

β-多样性解析结果表明窖泥质量与其微生物群落组成呈现明显相关性。

随着窖泥质量提高,优势原核微生物群落组成从单一的Firmicutes逐渐变为Firmicutes、Euryarchaeota和Bacteroidetes三个门;窖泥中核心属数目从2个属增加15属,主要集中于Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Methanomicrobia四个纲,尤其是Clostridia(7个属)。

(2)基于Spearman’s相关性的网络分析结果表明窖泥微生物之间的同现性主要集中在不同门的微生物之间,尤其是Firmicutes、Euryarchaeota、Bacteroidetes及Proteobacteria 四个门之间。

同现性网络图谱中约77%hubs属于Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria及Methanomicrobia四个纲且主要存在于优质和正常窖泥样品中,推测其对正常和优质窖泥生态体系的稳定起着重要作用。

负相关网络图谱中共发现3个hubs均为乳酸菌(Lactobacillus,Pediococcus和Streptococcus)且主要分布于退化窖泥样品中,与同现性网络图谱中的11个hubs呈现显著负相关作用,推测乳酸菌一旦成为优势菌群将导致正常及优质窖泥中正相关hubs的种类及含量逐渐减少甚至消失,进而导致窖泥微生物群落结构不稳定及窖泥质量退化。

此外,p H作为整合的理化参数与窖泥微生物群落多样性之间相关性最高,多样性(Shannon)指数从酸性环境到近中性环境时迅速增加然后稳定。

冗余分析(RDA)结果表明窖泥理化因子中的水溶性有机碳(DOC)、铵根离子(NH4+)、p H、有效磷(AP)及乳酸显著影响窖泥微生物群落结构(p<0.01),其中DOC对窖泥微生物群落结构影响最大;而总氮(TN)含量及含水量对窖泥微生物群落影响不显著。

(3)建立了从复杂菌群中快速解析梭菌纲微生物菌群组成及多样性的方法,
其核心环节是梭菌纲微生物通用性及特异性引物设计。

基于核糖体数据库项目(RDP)数据库中16S r RNA基因序列设计了梭菌特异性及通用性引物对(SJ-F和SJ-R),其扩增区域为原核微生物16S r RNA基因序列的V4和V5可变区。

理论验证结果表明梭菌引物98.6%的扩增子属于梭菌纲且对梭菌纲中的19个科及unclassified_Clostridia均有不同程度的扩增。

结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,引物SJ-F/SJ-R能特异性解析复杂微生物菌群体系(选取窖泥为代表)中梭菌菌群多样性,并检测到7个系统发育簇中的梭菌种属。

相比于细菌通用引物P3/P2,引物SJ-F/SJ-R对窖泥梭菌菌群组成及多样性解析更为灵敏、准确。

该方法可以推广至自然环境及其它厌氧发酵体系中梭菌菌群组成及多样性解析和梭菌菌群动态变化监控的研究。

(4)采用Illumina Miseq高通量测序技术结合梭菌特异性引物SJ-F/SJ-R 解析不同年份窖泥样品中梭菌群落多样性。

共检测到20个梭菌纲中的科及40个梭菌纲中的属,其中12个科及21个属在窖泥中未见报道。

系统发育分析将窖泥中主要梭菌可聚类为16个梭菌簇,在很大程度上丰富了人们对窖泥复杂微生态体系中大量未培养梭菌分类地位的认识。

Clostridiaceae及Tissierellaceae两个目是所有窖泥样品中含量都很高的梭菌,而1年窖泥中Lachnospiraceae及Mogibacteriaceae相对含量高于其它年份的窖泥样品,相反地,Anaerobrancaceae及Eubacteriaceae在30年及以上的窖泥样品中含量高于1年窖泥。

实时荧光定量PCR分析结果表明老窖(30年及30年以上)窖泥样品中梭菌菌群的含量(2.06×108-1.62×109 16S r RNA gene copies·g-1窖泥)比其在新窖(1年)窖泥中含量要高1-2个数量级。

(5)通过差异性解析可培养技术及未培
养技术得到的微生物信息与相应挥发性代谢物含量确定了Clostridium kluyveri为不同时空窖泥中的高产己酸梭菌。

代表菌株C.kluyveri N6所产挥发性代谢物包括脂肪酸类化合物:己酸、辛酸及丁酸;醇类化合物:1-丁醇、1-己醇及1-辛醇及乙酯类化合物:丁酸乙酯、己酸乙酯及辛酸乙酯。

丁酸、己酸、辛酸及其相应的乙酯。