实用文档之绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG 分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
绿色荧光蛋白的克隆实验汇报.
6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌 染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的 性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢 复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞， 本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低 渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失 去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细 胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合 物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物 混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了 很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视 场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且 还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的 观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的 贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深 对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
学号：班级：姓名：《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达指导老师：作者姓名：所在院系：小组编号：小组成员：完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。
1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。
而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
GFP基因的克隆与表达操作步骤
GFP基因的克隆与表达一、碱裂解法质粒DNA的小量提取所涉及溶液的配制：Solution Ⅰ： 50mmol 葡萄糖25mmol Tris Cl (pH8.0)10mmol EDTA (pH8.0)Solution Ⅱ： 0.2mol NaOH1% SDS使用前现配现用Solution Ⅲ：每100ml含： 5M KAC 60.0ml冰乙酸 11.5ml蒸馏水 28.5mlTE Buffer： 10mmol Tris Cl (pH8.0)1mmol EDTA (pH8.0)（1）取单菌落于5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，于37℃、200-250rpm振荡培养过夜（农杆菌在YEB培养基中，于28℃、250rpm振荡培养，时间相对长些）；（2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、12000rpm离心1分钟，吸弃上清（可重复一次，若菌种需要保存，需要在无菌条件下操作）；（3）向离心管中加入100－150l用冰预冷的Solution Ⅰ，用旋涡振荡器或用微量移液器吹打重悬沉淀；（4）加入200l新配制的Solution Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次（注意动作幅度不要太大），冰上放置5分钟(仔细观察加入Solution Ⅱ后有何现象出现？)；（5）加入150l用冰预冷的Solution Ⅲ，轻轻混匀（观察有何现象出现？），冰上放置3~5分钟；（6）用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，将上清转移到另一离心管；（7）加等体积酚、酚:氯仿(1:1)、氯仿抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、12000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中；（8）向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，弃上清（9）用70%乙醇洗涤1~2次，再次4℃、12000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥10分钟；用适量TE buffer溶解质粒DNA，加入1l 10mg/ml RNA酶，37℃处理1小时后使用或于-20℃贮存。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
前言 EGFP基因的克隆及表达
绿色荧光蛋白(GFP)
• 绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein, GFP) 是从太平洋水母中分离出来的一种荧光蛋白质, 为238 氨基酸组成的单体, 分子量约为27kD。
• 其野生型(wild-type GFP)的吸收/激发峰在395 nm , 在475 nm 有一个次要峰，发射峰为508 nm。对细胞无毒，用于转基因表达的检测。
质粒pEGFP-N3Байду номын сангаас谱
表达载体pET-28a
• pET表达体系是在大肠杆菌中克隆和表达 融合蛋白常用的体系之一。
• 使用T7Lac启动子； • BamHI下游存在转录终止信号； • 含有寡聚组氨酸链（His-tag),便于融合蛋白
的纯化。
pET- a
表 达 载 体
28 图 谱
3、无毒害：GFP 对生活的细胞基本无毒害,对目的基因的功能也没 有影响,转化后细胞仍可连续传代。
4、具有共用性和通用性：首先表现在GFP 的表达几乎不受种属范 围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是 GFP 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧 光。
5、易于构建载体：由于GFP 分子量较小，仅为27-30kD，编码GFP 的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒。
GFP 的应用特点：
1、检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用荧光显微镜甚至肉 眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。
2、荧光稳定：GFP 对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光 照；在pH范围在7-12 之间都能正常发光；对高温、碱、离子除垢 剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
具体实验步骤
Part01
Part02
Part03
P01 质粒DNA的提取
感受态细胞经 转化培养后， 平皿内有但菌 落长出。
P02 质粒DNA的提取
用灭菌吸头挑
取单菌落，浸
没于2 mL含有
P03
抗生素的LB液
体培养基中，
37 ℃, 180
r/min振荡培养
过夜。
质粒DNA的提取
取1.5 ml 培养 物倒入微量离心 管中，用微量离 心机于4 ℃、 11000 r/min 离 心1分钟，吸弃 上清。
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中 第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。
GFP的演化
通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基 酸, 得到变异GFP。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不 同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是 根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌 细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得 率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广 泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂， 宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两 条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量 大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分 子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速 配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。
实验设计——绿色荧光蛋白的表达
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
gfp 实验步骤
gfp 实验步骤GFP实验步骤GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。
下面将介绍GFP实验的步骤。
1. GFP基因的克隆需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。
通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。
连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。
2. 细胞培养接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。
培养条件要求适当的温度和培养基。
当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。
3. GFP的纯化提取细菌后，需要进行GFP的纯化。
纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。
通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。
4. GFP的表达将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。
可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。
在细胞培养的过程中，可以观察到GFP表达的情况。
5. 荧光显微镜观察使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。
荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。
可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。
6. 数据分析观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。
可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。
通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。
7. 应用GFP广泛应用于生物学研究中。
例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。
总结：GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。
通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。
GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。
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实用文档之"绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取"南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI 和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli 进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1目录1 前言 (4)2 实验目的 (6)3 实验设备 (6)4 材料及试剂 (7)5 实验操作步骤 (7)5.1操作流程 (7)5.2质粒DNA的分离与纯化 (8)5.2.1 质粒的培养 (8)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (8)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (9)25.3酶切及连接 (11)5.3.1 双酶切 (11)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (12)5.3.3 连接 (13)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (13)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (13)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (13)5.4.3 转化涂板 (14)5.5GFP蛋白的诱导表达 (15)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (15)参考文献 (16)附录 (17)1LB培养基的配制： (17)2.溶液Ⅰ (18)3.溶液Ⅱ (18)4.溶液Ⅲ（100ML） (18)5.DN ASE-FREE RN ASE A (18)6.TE缓冲液（P H8.0） (18)7.20×TBE (18)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (19)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (19)10．P ET-28A质粒全图谱 (20)31 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。
1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。
采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。
采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。
质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克4隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。
目前，感受态细胞的制备主要采用CaCl法，该方法操作简2单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的实验室。
其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[9]。
而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[10]。
大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[11]。
随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。
在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因10 的启动子及Lac启动子等。
Lac 启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。
根据原核生物基因表达特点选择载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质[12]。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内5成功诱导表达。
2 实验目的学会绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达整个过程中的每一步，掌握其方法。
本实验是通过基因工程手段对目的基因EGFP进行克隆，并进行EGFP表达载体的构建，并在大肠杆菌中诱导表达，获得GFP蛋白。
①学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法②学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳技术③学会用限制性内切酶切割DNA④学会用琼脂糖凝胶中回收DNA片段⑤学会DNA片段的体外连接技术法制备大肠杆菌感受态细胞⑥学会用CaCl2⑦学会用质粒DNA转化感受态受体菌的基本操作技术⑧学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌⑨了解外源基因在原核细胞中表达的特点和IPTG诱导表达的方法⑩学习SDS-PAGE胶的基本灌制方法和用SDS-PAGE检测表达蛋白3 实验设备恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪，水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫67外灯。
4 材料及试剂BamH I ；NotI(10U/μL)；T4 ligase ；LB 培养基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE 缓冲液；20×TBE ；GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液。
5 实验操作步骤5.1 操作流程质粒提取 质粒 提取酶切 回收 酶切 回收转 化导诱5.2 质粒DNA的分离与纯化5.2.1 质粒的培养1）在含有pEGFP－N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。
摇晃过夜。
2）有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。
5.2.2 质粒的DNA的碱提取法1）取1.5ml DH5α培养液倒入1.5mL eppendorf 管（微量离心管）中, 13000rpm离心1min。
2）重复1。
3）弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
4）菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置10min。
85）加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。
6）加入150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min。
7）上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min。
8）将水相移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min。
9）将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min。
10）弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70％乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min。
11）吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。
12）将沉淀溶于30μL TE缓冲液(pH8.0，含20μg/mL RNaseA)中，保存在-20℃冰箱中。
13）按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃冰箱中。
5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化1)1%琼脂糖凝胶的配制①加20ml 1×TBE缓冲液于三角瓶中，②精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，9③冷却至60℃左右，2)琼脂糖凝胶电泳①轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，②将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，③取5μl质粒DNA及2μl GeneFinder混匀上样④50-100v约电泳0.5-1小时⑤蓝盾可见光透射仪观察结果。
3)回收产物①用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。
②以0.1g凝胶对应300μL的体积加入PN。
③50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。
④将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，弃掉废液。
⑤加入800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
⑥加入500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
⑦将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。
⑧取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μL，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，室温10放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。
⑨置于－20℃保存。
5.3 酶切及连接5.3.1 双酶切按如下双酶切体系（30μL）混合:表1 双酶切体系的配制反应物（μL）pEGFP-N3 pET-28a质粒18 18BamH I 2 2Not I 2 210×buffer K 3 30.1%BSA缓冲液 3 3灭菌双蒸水至 30ul体系1)离心10s，混匀。