欧蒙抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)说明书
抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）说明书
【产品名称】抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）
【通用名称】Anti-CardiolipinELISA(lgG)
【包装规格】
血小
、
（类风
也是梗死后病情和预后监测的指标。
抗心磷脂抗体可有lgA、lgG或lgM亚型，诊断价值最高的是高浓度的lgG抗体，但很多患者血清中可检测出lgA和lgM型抗心磷脂抗体。才外，有证据表明高浓度的抗心磷脂lgG型抗体与血小板减少症高度相关，而高浓度的抗心磷脂lgM型抗体和溶血性贫血高度相关。
【检验原理】试剂盒中每个微孔板条有8个可拆分的包被有心磷脂的微孔。第一次温育时，稀释后的样本在微孔中反应。在很多情况下，抗心磷脂抗体识别抗原需要血浆蛋白（β2-糖蛋白1）作为辅助因子，为此，反应体系必含有这一辅助因子，如果样本阳性，特异性lgG（包括lgA和lgM）
与抗原相结合，为了检测结合的抗体，可加入发生颜色反应的酶标抗人lgG抗体（酶结合物）进行第二次温育，然后加入酶底物，发生颜色反应。
【主要组成成分】
1、不同批号试剂盒内的酶结合物、样本缓冲液、清洗缓冲液、色原/底物液和终止液可互换。
【储存条件及有效期】2-8℃保存，不要冰冻。未开封前，除非特别说明，试剂盒中各成分自生产之日起可稳定1年。
1、包被有抗原的微孔板：自第一次开封后，抗原包被的微孔板在干燥的2-8℃的环境中保存至少4
个月。
2、酶结合物：稀释后的酶结合物必须在稀释后的4小时内试用。
3、清洗缓冲液：稀释后的缓冲液于2-8℃最多可稳定一个月。
℃保存
、从第一
-标准品和对照血清:
-酶结合物：10倍浓缩，使用前应充分混匀，用干净的吸管吸取需要量的酶结合物用样本缓冲液1:10稀释，如：需温育一条微孔板条。则可取0.1ml浓缩酶结合物用0.9ml样本缓冲液稀释。已稀释的酶结合物必须在4个月内使用。
-样本缓冲液：直接使用
-清洗缓冲液：10倍浓缩。如果浓缩清洗缓冲液中出现结晶，稀释前应加热到37度并充分混匀溶解。用干净吸管从瓶中吸取需要量的浓缩清洗缓冲液用蒸馏水1:10稀释（1份浓缩清洗缓冲液加9
份蒸馏水）。如：需清洗一条微孔板，则可取5ml浓缩液清洗缓冲液用45m蒸馏水稀释。稀释后的缓冲液于2-8℃最多可稳定一个月。
-色原/底物液：直接使用。因内容物对光明感，试用后应立即盖好瓶盖。色原/底物液应为无色澄清，如果变蓝，则不要使用。
-终止液：直接使用。
操作流程
1、
（如
清洗：倒掉微孔板内的液体，如上述步骤清洗。
底物温育：滴加100ul色原/底物液至每一微孔，室温（18-25℃）避光温育15分钟。
终止反应：以与加色原/底物液相同速度和顺序滴加100UL终止液至每一微孔。
比色：450nm比色，参考波长620-650nm，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻振动微孔板以使液体扩散均匀。
加样方案
1-4
7-10
12PL-lgG-U/ml作为临界值，所有献血员工血清抗心磷脂lgG抗体阴性。
【检验结果的解释】
半定量：按照以下公式计算对照血清或者患者样本吸光度值和标准品2吸光度值的比值，通过比值半定量的判断结果：
比值=对照或者患者样本的吸光度值
，
复孔检测应取两孔检测结果的平均值进行计算。如果两孔间的值相差过大，应重做试验。
应结合病人的临床症状和血清学检查结果进行诊断。
【产品性能指标】
定标：标准品采用国际人标准血清（LouisvilleAPLDiagnostics,USA）订标，标准品单位为PL-lgG-U/ml。1PL-lgG-U/ml定义为经亲和层析从标准血清（Harriset.al1987）纯化得到的1ug/ml抗心磷脂lgG抗体结合心磷脂的活性。
每一组实验，标准品的吸光度和阳性对照、阴性对照的单位和/或比值必须在相应批号试剂的
参考范围内，试剂盒附有靶值参照表。如果实验结果超出额定范围，则说明实验结果不准确，应重做。
所用酶的活性与温度有关，如果不使用恒温器，吸光度值会有所不同。底物温育时室温（18-25℃）越高，吸光度值越高。温存时间不同也会引起同样的差异。但因标准血清会收到同样的影响，这种差异在计算结果时会在很大程度上得到补偿。
的黄疸对检测结果没有干扰。
复性。批内检测的CV基于20次检测的结果，而批间的CV则基于不同6天、每天4次检测的结果。
（
性为
警示：（
（
所有的组分都应被视作潜在传染源小心处理。其中部分试剂含有毒性的叠氮钠，应避免
接触皮肤。
废物处理：样本、标准品、对照品和温育过的微孔板条必须作为潜在传染源处理，试剂盒中所有试剂的处理必须遵循官方规定。
【参考文献】
1、AshersonR.A:A”primary”
2、AshersonR.A,Khamashta,M,A,Gil,A,et,al:Cerebrovasculardieaseandantiphospholipidantibodierinsyst ermiclupuserythematosus,lupus-likediease,andtheprimaryantiphospholipidsyndrome.Am,J,Med,86:391-2 99(1989).
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4、https://www.360docs.net/doc/cd2712730.html,ncet:113-115(1986).
5、https://www.360docs.net/doc/cd2712730.html,ncet:1211-1214(198
17、E-Mail：网址：
18、
19、售后服务单位名称：北京欧蒙生物技术有限公司
20、地址：北京市朝阳区北辰东路8号院1号楼19层1901-1907??邮政编号：?100101
21、电话：传真：
22、E-Mail：网址：
23、
24、[医疗器械注册证书编号]国食药监械（进）字2011第2401856号
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26、【产品标准编号】YZB/GEM?1095-2011
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酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
酶联免疫吸附试验
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施 酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。 1实验室操作人员的基本素质因素 实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2标本处理因素 实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3操作过程的影响因素 3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。 3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。 3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。 3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。 3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。 4试剂的影响因素 应选用有国家批准文号，质量保证的产品。试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 5采取措施，避免差错事故的发生 创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。
酶联免疫吸附实验ELISA操作规则(新手适用)资料
酶联免疫吸附实验ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的
elisa酶联免疫吸附实验报告材料
elisa酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为
酶联免疫吸附试验竞争法检测HBeAg的探讨
万方数据
万方数据
酶联免疫吸附试验竞争法检测HBeAg的探讨 作者：李熙梁 作者单位：云南省大理州第二人民医院检验科,671000 刊名： 检验医学与临床 英文刊名：LABORATORY MEDICINE AND CLINIC 年，卷(期)：2011,08(3) 参考文献(1条) 1.梁宝铎;曾真;赵祥胜乙型肝炎血清学标志间非特异性交叉反应的研究 1995(03) 本文读者也读过(10条) 1.王燕萍.詹峰加样方式对竞争法ELISA的影响及其对策[期刊论文]-现代中西医结合杂志2011,20(4) 2.王建华.唐勇.向军俭.王宏.杨红宇.凌钦婕镉离子多克隆抗体ELISA竞争法的初步建立[期刊论文]-中国生物制品学杂志2008,21(1) 3.李长贵.周铁群.王剑锋.邱平应用ELISA竞争法检测疫苗制品中残余的牛血清白蛋白[期刊论文]-中国生物制品学杂志2002,15(2) 4.成军.孙长责.成玉生.王国政.詹峰不同加样方式对竞争ELISA法检测抗HBc的影响[期刊论文]-临床检验杂志2008,26(3) 5.万善霞.徐修远.王建立.张淑萍间接竞争ELISA检测兔肉中氯霉素残留方法的确定[期刊论文]-动物科学与动物医学2004,21(7) 6.杜华.谢闻悦.贺柳杨.赵田.Du Hua.Xie Wen-yue.He Liu-yang.Zhao Tian引起HBV e系统双阳模式的另一种机制[期刊论文]-中国卫生检验杂志2008,18(12) 7.邢冬红.潘菊芬.黄焕军.缪慧单抗ELISA竞争法在测定激素中的应用研究[期刊论文]-天津医科大学学报2001,7(2) 8.陈先国.支海兵.滕颖牛瘟诊断技术规程中竞争法酶联免疫吸附试验的复核试验[期刊论文]-中国兽医杂志2007,43(6) 9.曹红.张国元.魏锦.马春蓉.臧泽林急性白血病患者血清新喋呤的变化及临床意义[期刊论文]-川北医学院学报2004,19(2) 10.唐中.张国元.郭晓兰.凡瞿明.周彤.邓仁兵乙型肝炎病毒前S1抗原与乙肝两对半定量检测的对比分析及意义[期刊论文]-四川医学2004,25(2) 本文链接：https://www.360docs.net/doc/cd2712730.html,/Periodical_jyyxylc201103049.aspx
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验 学院： 专业： 姓名： 学号：
一．实验原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 图1 ELISA实验原理示意图 二．实验材料 BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓 冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H 2SO 4 。
三．实验方法 1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。第二天取出，用PBS洗涤3-4次。 2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。 3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。 4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显 色20min，最后加入50μl、2M H 2SO 4 终止反应。 5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 四．实验结果 表1 酶联免疫吸附OD值检测表 目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。
酶联免疫吸附试验及其应用
酶联免疫吸附试验及其应用 作者：鲍行豪 一、前言 近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正 比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。
酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理与结果解释
酶联免疫吸附试验（ELISA） 基本原理与结果解释 基本原理： 一、包被 1、固相载体的要求 （1）、结合抗体或抗原的容量大 （2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面 （3）、不影响免疫反应性 （4）、利于反应充分进行 （5）、固相方法简便易行，快速经济 2、固相载体的材料：聚笨乙烯 3、包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体。 4、封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。 二、反应 加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。 标记酶的要求： (1)、活性高 (2)、性质稳定 (3)、专一性强 (4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5)、方法敏感，重复性好，简单易行 (6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 常用酶 辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶） 三、洗涤
使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。 四、底物显色 HRP DH2+H2O2—————→D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。 常用底物：四甲基联苯胺TMB 四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。 常用方法与原理 一、双抗体夹心法 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 二、双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似双抗体夹心法 应用：乙型肝炎表面抗体
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
更新时间：2004-12-210:30:00 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定 加入酶反应的底物后，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的
单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA 提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
elisa酶联免疫吸附实验报告
e l i s a酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit
酶联免疫吸附实验汇总
ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的 应用 简介 随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 辣根过氧化物酶 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA 一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。 酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体
由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 1.辣根过氧化物酶（HRP） 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。