5-烯丙基-7-二氟亚甲氧白杨素抑制肝癌细胞NF-κB表达的研究

第２５卷　２０ｌ１年　第６期　ｌ２月　长治医学院学报　

１ｏＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＨＡＮＧＺＨＩ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＣＯＬＬＥＧＥ　Ｖ０１．２５　Ｎｏ．６　

Ｄｅｃ．　２０１１　４０Ｉ　

・基础研究・　５一烯丙基一７一二氟亚甲氧白杨素抑制　肝癌细胞ＮＦ—ＫＢ表达的研究　

王　宇　周建国　周秀田　摘　要　目的：研究５一烯丙基一７一二氟亚甲氧白杨素（ＡＤＦＭＣｈＲ）抑制体外培养人肝癌ＳＭＭＣ一７７２１　细胞增殖和诱导凋亡作用及机制。方法：体外培养ＳＭＭＣ一７７２１细胞，ＭＴＴ比色法测定ＡＤＦＭＣｈＲ对　ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖活性的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法分析ＡＤＦＭＣｈＲ对ＳＭＭＣ一７７２１细胞ＮＦ—ｋＢ蛋　白表达活性的影响。结果：ＭＴＴ比色法结果显示ＡＤＦＭＣｈＲ有效抑制ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖活性，呈剂　量依赖性，其ＩＣ５。值为３．５６　Ｍ；Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ分析证实ＡＤＦＭＣｈＲ下调ＮＦ一，ｃＢ蛋白表达，呈浓度和时间　依赖性。结论：ＡＤＦＭＣｈＲ具有抑制人肝癌ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖和诱导细胞凋亡作用，其机制与ＮＦ—ｘＢ　蛋白表达有关。　关键词　肝癌；白杨素；５一烯丙基一７一二氟亚甲基白杨素；细胞凋亡　中图分类号Ｒ３６１　文献标识码Ａ　文献编号１００６一（２０１１）０６—４０１—０４　

Ａｎｔｉｈｅｐａｔｏｍａ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　５一ａｌｌｙ－７’ｇｅｎ－ｄｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｙｌｅｎｅｃｈｒｙｓｉｎ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｏｗｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ－ＫＢ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｃｈｒｙｓｉｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　Ｗａｎｇ　Ｙｕ，Ｚｈｏｕ　Ｊｉａｎｇｕｏ，Ｚｈｏｕ　Ｘｉｕｔｉａｎ　Ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｚｈｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔ０　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　５－ａｌｌｙ－７一ｇｅｎ－ｄｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｃｈｒｙｓｉｎ（ＡＤＦＭＣｈＲ），ａ　ｎｏｖｅ１　ｃｈｒｙｓｉｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ　ｃａｎｅｅｒ（ＳＭＭＣ一７７２１）ｅｅｌｌｌｉｎｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：　ＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡＤＦＭＣｈＲ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭＭＣ一７７２１　ｃｅｌｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ－ＫＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＳＭＭＣ一７７２ｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＡＤＦＭＣｈＲ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｌｉ／ｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭＭＣ一７７２１　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｉｔｓ　ｌＣ∞ｗａｓ　３．５６“Ｍ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ－￣Ｂ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ａｎｄ　ｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡＤＦＭＣｈＲ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ＳＭＭＣ一７７２１ｃｅｌ１　ｌｉｎｅ．Ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ－ＫＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ；Ｃｈｒｙｓｉｎ；５－ａｌｌｙ－７一ｇｅｎ－ｄｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｙｌｅｎｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　

白杨素（Ｃｈｒｙｓｉｎ，ＣｈＲ），即５，７一二羟基黄酮，　在植物界蔬菜、水果中分布广泛　，是一种具有广　泛药理活性的黄酮类化合物，包括：抗癌、抗氧化、　作者单位１长治医学院病理学教研室（０４６０００）　２南华大学肿瘤　研究所　通讯作者　基金项目　湖南省医药卫生科研基金（Ｂ２ｏｏ６—１０２）　拮抗雌激素、抗病毒等作用。实验研究显示：白杨　素调控肿瘤坏死因子ａ（ＴＮＦ—ａ）的表达诱导人肝　癌细胞凋亡［２］。但因其肠道吸收甚少，羟基与葡萄　糖醛酸结合迅速糖基化代谢导致活性降低＿３］，限制　了它在体内抗肿瘤作用的发挥。有研究表明：将二　氟亚甲基、三氟甲基、硝基等亲脂性基团的引人有　４０２　长治医学院学报　助于增强黄酮类化合物的抗肿瘤活性＿４　；将碘引入　得到的８一碘白杨素衍生物也具有较好的抗癌活　性ｌ５］。本文将具有提高生物活性的烷氧基和较强　亲脂性的二氟亚甲基引入白杨素获得衍生物ＡＤ—　ＦＭＣｈＲ，并探讨此衍生物的抗肿瘤作用。　１材料和方法　１．１　药物及试剂　白杨素衍生物５一烯丙基一７一二氟亚甲氧白杨素　（ＡＤＦＭＣｈＲ）由湖南师范大学医学院药学系药物　化学室合成，分子式：Ｃ　。Ｏ　Ｈ　Ｆ　；分子量３４４，性　状为淡黄色晶体，纯度９９．０％；新生牛血清购自杭　州四季青生物工程材料有限公司；ＰＲＭＩ一１６４０培　养基为美国Ｇｉｂｃｏ公司产品；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）　为美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司产品；ＭＴＴ为美国Ｓｉｇｍａ公　司产品；兔抗人ＮＦ—　Ｂ多抗及二抗购均于美国　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司。　１．２细胞培养　人肝癌细胞（ＳＭＭＣ一７７２１）购于中国科学院上　海细胞生物研究所。用含１Ｏ　小牛血清的ＲＰＭＩ一　１６４０培养基于５％ＣＯ。混合气体、３７℃、９５　饱和　湿度的培养箱内培养，取对数生长期细胞用于　实验。　１．３　实验方法　１．３．１　ＭＴＴ比色法：取对数生长期细胞，接种　于９６孔平底培养板，每孔１８０　Ｌ（含１×１０　细　胞）。培养６　ｈ加入处理因素并设空白对照组，使　ＡＤＦＭＣｈＲ的终浓度为０．３，１．０，３．０，１０．０，３０．０　／，Ｍ，阳性药物对照组加入２￣ｇ／ｍＬ的５一Ｆｕ，先导　对照组加入１０．０　Ｍ的ＣｈＲ，溶媒对照ＤＭＳＯ为　０．１％，每组设６个复孑Ｌ处理４８　ｈ。然后每孔加　入ＭＴＴ　２０　Ｌ（５　ｍｇ／ｍＬ），于４　ｈ后终止培养，弃　去上清液，每孔加入２００　Ｌ　ＤＭＳＯ，振荡摇匀，调　节酶联免疫检测仪在５７０　ｎｍ波长处测量吸光度　（Ａ）值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：ＩＲ（　）　一（１一实验组Ａ均值／对照组Ａ均值）×１００　。　１．３．２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测：ＡＤＦＭＣｈＲ　（１．０，３。０，１０．０　Ｍ），ＣｈＲ（１０．０　Ｍ），溶媒对照　组ＤＭＳＯ为０．１　，处理ＳＭＭＣ一７７２１细胞２４　ｈ。　参照文献Ⅲ进行细胞蛋白质的提取、定量和分离；　使用１００　ｍＡ电流，转膜２～３　ｈ；用含５０　ｇ／Ｌ脱脂　奶粉的ＴＢＳＴ封闭膜３　ｈ；加一抗４℃孵育过夜；　ＴＢＳＴ清洗，加相应的二抗室温孵育１　ｈ；用ＥＣＩ　发光法显色，曝光，显影，定影，水洗；然后胶片采用　薄层色谱扫描仪测定印迹区带的光密度值。　１．４　统计学分析　各组实验数据均用ｉ±Ｓ表示，采用Ｓｐｓｓ　ｗｉｎ—　ｄｏｗｓｌ１．５软件Ｏｎｅ　Ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ方式行方差分　析，两两比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔ’Ｓ　ｔ检验，Ｐ＜０．０５为　统计学意义显著性标准。　

２　结果　２．１　ＭＴＴ比色法测定ＡＤＦＭＣｈＲ对　ＳＭＭＣ一７７２１细胞增殖活性的影响　随着药物浓度的增加，ＡＤＦＭＣｈＲ对ＳＭＭＣ－　７７２１细胞的生长抑制作用明显增强，具有剂量相　关性，Ａ　。值显著降低，ＩＣｓ０值为３．５６　Ｍ（见图　１）。ＣｈＲ组１０．０　Ｍ，阳性组５一Ｆｕ　２＞ｇ／ｍＬ的细　胞增殖活性分别为（３２．３６　４－０．５２）　，（２５．４３±　０．３７）　

０　０．３　１．０　３．０　ｌ０．０　３０．０　ＡＤＦ￣ＣｈＲ　ｕ　Ｍ　与溶媒对照组比较Ｐ＜０．０５　

图１　ＡＤＦＭＣｈＲ对ＳＭＭＣ一７７２ｌ细胞增殖活性的抑制作用　

２．２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测ＡＤＦＭＣｈＲ对　ＳＭＭＣ一７７２１细胞ＮＦ＿ＫＢ蛋白表达的影响　为了探讨ＡＤＦＭＣｈＲ诱导ＳＭＭＣ一７７２１细胞　凋亡机制，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测ＮＦ—ＫＢ蛋白表　达的影响（见图２）。结果发现：ＡＤＦＭＣｈＲ（１．０，　３．０，１０．０　Ｍ）孵育２４　ｈ，ＳＭＭＣ－７７２１细胞ＮＦ—　ＫＢ蛋白表达以浓度依赖方式下调。ＡＤＦＭｃｈＲ　（３．０雎Ｍ）分别处理６，１２，２４　ｈ后，ＮＦ—ｘＢ蛋白表　达较对照组均有下调。　

１　１　Ｏ　Ｏ　Ｏ　０　ｈｐ＝．｝　日　》＇［Ｈ０ｕ　王宇等．５一烯丙基一７一二氟亚甲氧白杨素抑制肝癌细胞ＮＦ－　Ｂ表达的研究４０３　ＣｔｔＲ　ＰＢＳ　１．０　３．０　ｌ０．０　ｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｕ　Ｍ）　

图２　ＷｅＳｔｅｒｎ　Ｂ１ｏｔｔｉｎｇ法检￣＇ＪＡＤＦＭＣｈＲ对ＮＦ—Ｋ　Ｂ蛋白表达的影响　

Ａ，Ｂ分别为ＳＭＭＣ－７７２１细胞ＡＤＦＭＣｈＲ（１．０，３．０，１Ｏ．０　Ｍ）处理２４　ｈ及３．０　ｔ￣ｌＶＩ　ＡＤＦＭＣｈＲ处理６　ｈ，１２　ｈ，２４　ｈ后　ＮＦ—　Ｂ蛋白表达状态。柱形表示三次实验样品测定值的均数与标准差；　与溶媒对照组比较Ｐｄ０．０５。　

３　讨论　黄酮类化合物是植物在长期自然选择中所产　生的一些次级代谢物，广泛存在于水果、蔬菜、药用　植物和牧草中。黄酮类化合物的生物活性及细胞　毒性与构效关系研究表明，具有５，７一二羟基结构者　其细胞毒性较强。白杨素（Ｃｈｒｙｓｉｎ，ＣｈＲ）是从紫　蒇科植物木蝴蝶中提取出的一种黄酮类化合物具　有广泛药理活性。据报道，白杨素能诱导人直肠癌　（Ｃａｃｏ一２）细胞和人肝细胞癌（ＨｅｐＧ２）细胞尿苷酸　二磷酸一葡萄糖醛酸转移酶（ＵＤＰＧＴｓ）的表达和活　性，抑制致癌物质ＰｈＩＰ（２一氨基一１一甲基一６一苯唑吡　啶）诱导基因突变而发挥抗肿瘤作用［７］。研究表　明，白杨素能显著抑制人甲状腺癌细胞生长　；白　杨素还可以通过拮抗雌激素受体，抑制人乳腺癌细　胞ＤＮＡ合成　；白杨素及其衍生物具有抑制鼠单　核巨噬细胞（ＲＡＷ２６４．７）环氧合酶一２（ＣＯＸ－２）和　诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）活性而发挥抗炎及抗　肿瘤作用　】　。　肝癌因其生长隐秘、发展迅速，约７０　９／６的患者　就诊时已属晚期，临床Ⅲ～Ⅳ患者五年存活率仅约　１４　９／５～２９　。常用的化疗药物顺铂、环磷酰胺、紫　杉醇等有效率低且副作用多。因此研究高效、低毒　的抗肿瘤新药具有　会和经济意义。白杨素具有　抗肿瘤作用，能显著抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤　细胞凋亡。ＭＴＴ比色法的实验结果显示：　ＡＤＦＭｃｈＲ有效地抑制人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞　增殖活性，显著促进ＳＭＭＣ一７７２１细胞凋亡，其效　价强度高于先导化合物白杨素。进一步证实　ＡＤＦＭＣｈＲ的抗肿瘤作用较先导物更强。　ＮＦ—ｘＢ是一类核蛋白因子，具有多向性转录调　节作用，通常由ＰＳ０和Ｐ６５构成异源二聚体，静息　状态下ＮＦ—ＫＢ位于细胞浆内与ＮＦ一　Ｂ抑制蛋白　（ＩｋＢ）结合呈非活性：状态。一旦受到病毒、细菌毒　素、细胞因子等因素刺激，使ＮＦ—ｇＢ与ＩｋＢ解离，　由细胞质进入细胞核内Ｅｌ１］，则与靶基因序列上存　在的ＮＦ—ｋＢ结合位点结合，促进靶基因的转录，调　控基因表达，阻断细胞凋亡。ＮＦ—ｘＢ可直接作用于　ＤＮＡ复制或上调ＣｙｃｌｉｎＤ１的转录，进入细胞周期　ｓ期，使细胞过度增殖，发挥其对抗凋亡的功能，导　致癌症发生。ＮＦ—ＩｃＢ还上调ＴＲＡＦ１和ＴＲＡＦ２的　表达，从而阻断ｃａｓｐａｓｅ一８的激活，抑制Ｂａｘ基因表　达和诱导Ｂｃｌ一２基因表达［１　。有研究报道，在鼠单　核巨噬细胞（ＲＡＷ２６４—７）中，白杨素可以通过强烈　抑制ＩｋＢ的降解，降低脂多糖（ＬＰＳ）诱导的ＮＦ－￣Ｂ　在核内的表达；白杨素在宫颈癌ＨｅＬａ细胞可以抑