实验3 化脓性球菌的分离鉴定
常见病原性细菌的分离鉴定方法1
一、葡萄球菌属
1．葡萄球菌的镜下形态 2．葡萄球菌的培养特性 3．葡萄球菌的生化反应
(1)血浆凝固酶试验 (2)触酶试验 (3)甘露醇发酵试验
葡萄球菌镜下形态观察（学生操作）
取葡萄球菌培养物少许涂片，革兰 染色，镜检。观察结果填入实验报告。
革兰染色后细菌呈紫蓝色，球形或椭 圆形，直径0.5—1.2µm，排列成葡萄串状。
肺炎球菌与甲型溶血性链球菌的鉴别
取肺炎球菌和甲型溶血性链球菌
分别接种于菊糖发酵培养基，置
胆汁或胆盐3能7℃活培化养肺2炎4h球～菌48自h，溶可酶见，肺促炎球
1.
菊糖发酵试验使细菌裂解菌自分溶解。菊分糖别、取产肺酸炎，球使菌培和养甲基变
型溶血性链红球色菌，0而．甲8m型l于溶2血支性试链管球中菌，培养
取肺炎球菌培养物涂片，革兰染色， 镜检。
革兰染色阳性，常呈双排列。菌体呈 矛头状，尖端向外钝端相接。无芽胞，无 鞭毛，在人及动物体内能形成荚膜。
肺炎链球菌菌落观察（教师示教）
取肺炎球菌培养物，接种于血平板， 置37℃培养，18h～24 h后观察血平板 上生长的菌落大小。形态、溶血性。
在血平板上与甲型溶血性链球菌很 相似，形成细小、灰白、圆形略扁、半 透明，直径0.5—1.5mm的菌落，有甲型 溶血环。
致病性葡萄球菌产生血浆凝固酶，它 可以使经过枸橼酸钠或肝素抗凝的兔血浆 凝固。本试验采用玻片法测定结合凝固酶。
在载玻片两端滴加生理盐水一滴，用 接种环挑取待检菌(金葡菌、白葡菌)， 分别与它们研磨、混匀，滴加兔血浆1滴， 立即观察有无凝固颗粒，若有即为阳性。 此法用于测定结合型凝固酶。
二、链球菌属
常见病原性细菌 的分离鉴定方法1
学习要求
1．熟悉一般细菌的鉴定流程。 2．掌握化脓性球菌的鉴定方法。 3．掌握肠道细菌的鉴定方法。
化脓性球菌分离鉴别的流程
化脓性球菌分离鉴别的流程英文回答：Identification of Pus-Forming Cocci.The identification of pus-forming cocci, such as Staphylococcus and Streptococcus species, is essential for appropriate antibiotic therapy and infection control measures. The following steps outline a general procedure for their identification:1. Specimen Collection: Collect specimens from the infected site, such as wound swabs, blood, or sputum.2. Gram Staining: Perform Gram staining on the specimen to determine the morphology and staining characteristics of the bacteria. Pus-forming cocci are typically Gram-positive and appear as cocci (round or oval cells).3. Colonial Morphology: Culture the specimen onappropriate media, such as blood agar or chocolate agar, and observe the colony morphology. Staphylococcus species often form colonies that are round, opaque, and golden or white in color, while Streptococcus species tend to form colonies that are beta-hemolytic, meaning they cause a clear zone of hemolysis around the colonies.4. Catalase Test: Differentiate between Staphylococcus and Streptococcus species using the catalase test. Staphylococcus species produce the enzyme catalase, which breaks down hydrogen peroxide into water and oxygen, creating bubbles during the test. Streptococcus species do not produce catalase and therefore do not elicit a positive result.5. Coagulase Test: Further differentiate Staphylococcus species using the coagulase test. Staphylococcus aureus, a common pathogen, produces the enzyme coagulase, which converts fibrinogen into fibrin, causing clot formation in the test. Other coagulase-negative Staphylococcus species do not produce this enzyme.6. Hemolysis Test: Determine the hemolytic propertiesof Streptococcus species on blood agar plates. Beta-hemolytic Streptococcus species cause a clear zone of hemolysis around the colonies, while alpha-hemolyticspecies produce a greenish zone of hemolysis, and non-hemolytic species do not cause any hemolysis.7. Lancefield Grouping: Further differentiate Streptococcus species based on their Lancefield group antigens. This involves using specific antibodies to determine the group (A, B, C, D, etc.) to which the Streptococcus species belongs.8. Antibiotic Susceptibility Testing: Performantibiotic susceptibility testing to determine the appropriate antimicrobial agents for treating the infection.中文回答：化脓性球菌分离鉴别流程。
医学微生物学化脓性球菌
抗菌药物研究
针对化脓性球菌的抗菌药物研究主要集中在新型抗生素的发现和已有抗生素的 改良，以克服细菌耐药性问题。
新型疫苗与免疫治疗研究
新型疫苗
针对化脓性球菌感染的新型疫苗研究，旨在通过激发机体免疫反应，预防和治疗 感染。
抗菌药物的剂量和疗程
抗菌药物的剂量和疗程应根据患者的病情和医生 的建议来确定，以确保治疗效果和防止耐药性的 产生。
抗菌药物的联合应用
在某些情况下，可能需要联合应用多种抗菌药物 来治疗化脓性球菌感染。联合应用抗菌药物时应 谨慎，并遵循医生的建议。
05
化脓性球菌研究进展
耐药性与抗菌药物研究
耐药性机制
治疗。
综合治疗
在治疗过程中，应注意 休息，遵医嘱治疗，同 时保持良好的生活方式
和饮食习惯。
防止传播
在治疗过程中，应注意 防止感染传播给其他人
或动物。
抗菌药物选择与应用
1 2 3
根据病菌类型选择抗菌药物
不同类型的化脓性球菌对不同的抗菌药物敏感程 度不同，因此应根据具体的病菌类型选择合适的 抗菌药物。
免疫治疗
免疫治疗作为一种新型治疗方法，通过调节机体免疫系统，增强对化脓性球菌的 清除能力。
感染机制与防治策略研究
感染机制
深入了解化脓性球菌的感染机制，有助于为防治策略提供理 论依据，降低感染风险。
防治策略
针对化脓性球菌的防治策略研究，包括预防措施、早期诊断 和有效治疗等方面的研究。
THANKS
感谢观看
临床表现与疾病类型
疖
疖是化脓性球菌引起的皮肤感染 ，表现为局部红肿、疼痛，可形
微生物学实验设计_案例导入_皮肤化脓性病原菌的分离和鉴定
化脓性球菌的防治原则
注意个人卫生，要及时用消毒药物处理皮肤创伤（如碘酊）等 预防交叉感染，减少同带菌者或有相似症状的人有皮肤接触，
可疑体现在： （1）菌落周围出现溶血环 （2）菌落颜色为金黄色
生物化学反应鉴定： 甘露醇分解试验（+） 血浆凝固酶试验（+） 耐热核酸酶试验（+）
血清学检测SPA：协同凝集 试验（+）
引起皮肤化脓 性感染的细菌 为金黄色葡萄
球菌
致病性葡萄球菌的鉴定—血浆凝固酶实验
实验原理：许多病原性的葡萄球菌菌株在代谢过程中能产 生一种血浆凝固酶样物质，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝 剂的兔或人血清发生凝固，而非致病病株一般不产生此酶， 故凝固酶可作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
勤洗手，勤洗澡，对于脸部的化脓，不要将其抓破或挤出，因 脸部的化脓位于危险三角区及其附近，极易引起颅内感染引起 严重后果 由于金黄色葡萄球菌易产生耐药性，治疗因根据药敏实验结果 针对性的选用窄谱抗生素，防止耐药性菌株扩散 对于反复发作的顽固性疖疮，宜采用自身菌苗进行人工自动免 疫，有一定疗效（原理是重建皮肤微生态平衡，粪菌移植也是 运用这个原理） 少熬夜，养成正常的作息习惯，多吃蔬菜水果，帮助机体恢复
皮肤化脓性病原菌的分离与鉴定
案例导入
机械学院王斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶， 经久不愈。请设计一个方案：从脓汁中分离、鉴定 化脓性病原菌，并提出防治原则。
分析原因
皮肤表面的正常细菌群：皮肤表面常见的细菌有类白喉杆菌、凝固酶 阴性葡萄球菌、丙酸杆菌、假单孢菌、分枝杆菌、变形杆菌、大肠埃 希菌、不动杆菌、克雷伯菌等
实验3化脓性球菌的分离鉴定
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形 成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm ： 极度敏感 15-20mm ： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm ： 轻度敏感 <10mm: 不敏感 无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
成对排列
操作：
1. 接种血平板（ 1块/人） 三线法接种分离单个菌落
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。
优点： 1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。
2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打开 取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm 的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm 最强，这与 DNA的吸收光谱范围一 致。紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改 变DNA的分子构型，干扰 DNA的复制与转录，导 致细菌的死亡或变异。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术
掌握： 1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
化脓性球菌的分离鉴定
A群链球菌的防治原则
A群链球菌
主要通过飞沫传播，应对病人和带菌者及时治疗，以减少传染源。另 外，还应对空气、器械和敷料等消毒。对急性咽喉炎和扁桃体的病人， 尤其是儿童，须彻底治疗。以防止急性肾小球炎、风湿热和亚急性细菌 性心内膜炎的发生。首选药物为青霉素G。
葡萄球菌的鉴定
2.生化反应检测
2.1 血浆凝固酶试验
原理：金葡菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维 蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，结合型血浆凝固酶附着于细菌 表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中 的血浆发生凝固；
方法步骤（玻片法）：在在玻片两端各滴生理盐水1d，取肉 汤培养菌液与生理盐水混匀，在其中一端的菌液中滴加兔血浆 1d混匀，观察结果。因致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可 凝固兔血浆，故如血浆中明显小凝块出现，而生理盐水中无此 现象者为阳性，若血浆中无凝块时为阴性。
A群链球菌的鉴定
3.2 吡咯烷酮试验（PYR）检验方法
原理：特异检验A群链球菌氨基肽酶 方法步骤： • 用PYR缓冲液A液浸润PYR测试条末端滤纸； • 用接种环从适合的琼脂培养基上挑取可疑待测菌落，在末端滤纸上
涂抹开或直接蘸取菌落； • 放置于密闭容器；35℃±2℃，孵育5min~10min； • 滴加一滴PYR缓冲液B液至末端涂抹细菌处，观察是否有红色产生。
化脓性炎症是临床上常见病。但是除了 病原性球菌外，其他微生物也可以引起化脓 性感染。
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰液、血 液、脑脊液等。
本次实验以脓汁标本进行病原性球菌的 分离鉴定。
脓汁中病原球菌的查程序
涂片： 革兰氏染色
血琼脂平板 （分离培养）
化脓菌分离鉴定过程
系统实验报告（报告三） 化脓菌/肠道菌分离鉴定过程 目的 策略（原理设计） 方法步骤：简单写 结果（判定方法） 结论
协同因子
纤维蛋白原
Tube coagulase Test
＋
－
The Slide Coagulase Test
细菌的药物敏感性试验
纸片扩散法（K-B法）
肠道菌分离鉴定过程（三）
Antigens of salmonella
O antigen polysaccharide of LPS used to divide Salmonella to 42 groups （A－Z，O51－63，O65－67） A-E groups are pathogenic H antigen flagella antigen divide Salmonella tow phase: special no special Vi antigen related to the virulence of Salmonella sensitive to heat ( lose activity at 60℃)
React with anti-Vi antiserum
Agglutination reaction
(＋) (－)
Identify its group and phage
化脓菌分离鉴定过程（三）
化脓菌分离鉴定过程
葡萄球菌 甘露醇发酵试验 试验
Inoculate the bacteria into a mannitol micro-tube Incubate at 37℃ for 18h. S.aureus will ferment mannitol to produce acid, which causes the medium to turn yellow.
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定
血液标本培养
增菌培养
标本接种于硫酸镁葡萄糖肉汤中（1:5～1： 10），37℃孵育，每日观察，连续7天。如疑有 菌生长，涂片、革兰染色、镜检，初步报告。
根据涂片结果，选择相应的抗菌药物进行初 步药敏试验
自动血培养检测系统
• 原理：细菌和真菌生长时释放CO2，通 过各种手段检测CO2来判断阴阳性
A群链球菌 “敏感”
药物敏感试验
检测分离 菌株对各种药物 的敏感性，为临 床治疗提供依据
Diameter of zone of inhibition(mm)
Antibiotic Resistant Intermediate Sensitive
Penicillin G ≤20
(S*.aureus ≤11 E.coli)
培养基的制备
基础培养基（营养肉汤） 牛肉膏 0.3% 蛋白胨 1% NaCl 0.5% pH 7.2-7.6
营养琼脂：营养肉汤添加1.5%琼脂 半固体培养基：营养肉汤添加0.25%琼脂
培养基的制备
培养基制备的基本过程
1. 调配成分：加定量蒸馏水， 准确称取各成分，混合 2. 溶解：沸水浴 3. 校正pH：用NaOH校正，高压灭菌后，下降0.1-0.2 4. 滤过澄清 5. 定容、分装：斜面（试管高度的1/3-1/4） 6. 灭菌：121℃ 15-20min
21～28
≥29
12～21
≥22
Streptomycin ≤11
12～14
≥15
Amikacin ≤14 Cefradine ≤14
15～16
≥17
15～17
≥18
Minocyline ≤14
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➢ 防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。
➢ 无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。 3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装） 4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人） 2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线 3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果 7. 注意操作中始终保持无菌操作
➢ 常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑 脊液等。
➢ 本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定
化脓性球菌分离鉴定步骤
脓汁 接种
划线法
血平板
37℃
24h
菌落
革兰染色
葡萄状排列 链状排列
血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验 血清肉汤管
成对排列
操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法
湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、
煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法
紫外线
电磁波辐射杀菌法
滤过除菌法
电离辐射
超声波杀菌
干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰
药敏试验的常用方法：纸片法
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形 成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感 <10mm: 不敏感 无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
➢ 化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。
优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
CTCCTTOHOOHHLILLIIRLRRLLDEDEDEGGGMMMEEEIIILOLOLOIIIFFTTFTAABBABRARARAYSYSYSIIIMMCCMCEMEMEMDDEEDEIIDDICDCCIIAAICCACLLALAALULULUNNSSNSCICICVIIVIVEIEEEEENRNRNRSCSCSCIEIETIETSTYSYSY
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。
2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打开 取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一 致。紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改 变DNA的分子构型，干扰DNA的复制与转录，导 致细菌的死亡或变异。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术
掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
➢ 消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物，并 不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。用 以消毒的药品称为消毒剂。
微生物学实验三
化脓性球菌的分离鉴定
（综合性菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 2. 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 3. 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 4. 普通平板、血平板、黑纸片等
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射
➢ β射线和γ射线； ➢ 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导
致酶系统功能紊乱等; ➢ γ射线有较高穿透力； ➢ 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用
于食品消毒，不破坏其营养成分。
滤过除菌：
❖ 物理阻留； ❖ 用于不耐高温的血清、
抗生素、药液等的除菌。
2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢， 高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益增 加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带来 了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细菌 的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用各 种抗生素的敏感性。