医学遗传学实验考试1

医学遗传学实验考试1

1．请说明小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程，各步骤和所用试剂的作用，以及染色体制备技术在医学中的用途。

答：小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程：

①前处理：在实验前24～36小时，按0.5ml/25g体重的剂量往小鼠腹腔内注射预温至37℃的10℅的酵母葡萄糖溶液。

②注射酵母液24～36小时后，往小白鼠的腹腔内注射秋水仙素（注射量按

8.4ug/1g体重计算），注射后10～12小时取材。

③取股骨：用颈椎脱臼法处死小鼠，立即用剪刀剪掉大腿上的皮肤和肌肉，暴露股骨及其两端相连的关节和膝关节。然后从肌骨两端关节头处剪下股骨，用卫生纸擦净股骨上残余的肌肉和血液。

④收集骨髓细胞：剪掉股骨两端膨大的关节头，暴露出骨髓腔，用吸有适量生理盐水的注射器从股骨一端插入注射针头，将骨髓冲入10ml刻度离心管内，可反复冲洗数次，直至股骨变白为止。此时离心管中的细胞悬液可达6～8ml，将离心管平衡后放入离心机以1000rpm/min离心8分钟。

⑤低渗处理:吸去上清夜，留沉淀物，加入6～ 8ml0.075mol/L氯化钾低渗液（低渗液需先置37℃水浴箱内预温），用吸管将细胞团吹打均匀，置37℃水浴箱内低渗处理15分钟。

⑥预固定：低渗处理完成后，立即加入1ml新配制的固定液，混匀后以1000rpm/min离心8分钟。

⑦固定：吸去上清夜，加入固定液6～8ml（甲醇∶冰乙酸＝3∶1），用吸管吹打混匀静置15分钟。然后以1000rpm/min离心8分钟，吸去上清夜。

⑧重复第7步骤。

⑨制备细胞悬液：吸弃上清夜后，视离心管底细胞沉淀量的多少而加入3～8滴固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

⑩滴片：吸取细胞悬液滴到预冷的载波片上，每片滴2～3滴，然后立即对准玻片吹一口气，使细胞悬液散开，并迅速将玻片在酒精灯火焰上来回过几次以助染色体分散。

11染色：将制备好并晾干的染色体标本片放在染色架上，用吸管吸取Giemsa染液（用1ml原液加9mlpH6.8的PBS混合而成，现配现用）1～2ml滴到玻片上并使之铺展开，染色5～10分钟，用自来水轻轻冲去染液，晾干待镜检。

所用试剂的作用：

①10％酵母葡萄糖溶液：促进小鼠骨髓细胞有丝分裂，提高骨髓细胞有丝分裂指数，激活免疫系统。

②1mg/ml秋水仙素：骨髓细胞可用于直接进行染色体标本制备的原因在于其具有旺盛分裂的能力,但是由于中期时相较整个细胞周期的时相相对极短,

所以骨髓细胞的分裂若未经中期阻断的话,骨髓内正好位于分裂中期的细胞是不多的。为获得较多的中期分裂相,实验中一般采用秋水仙素于处死小鼠前4 h 左右对小鼠进行中期阻断,原理是秋水仙素可以抑制微管的聚合从而抑制纺锤体的形成,将细胞阻断在有丝分裂中期。处于间期的细胞由于受药物的影响相对较弱,常可持续运转到分裂期,因而在药物持续存在的情况下中期细胞的数量会逐渐增加。

③0.85%生理盐水：冲洗骨髓腔获得骨髓细胞，提供细胞生长微环境。

④0.05mol/L氯化钾低渗液：使细胞吸水膨胀破裂,核膜变脆，并有利于染色体分开。

⑤固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）:使酶失活，通过固定可使染色体形态清晰、分散良好。

染色体制备技术在医学中的用途：

①骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系统细胞增生情况，这些病人不宜用外周血。即使是淋巴细胞性白血病，也不主张用外周血，因为加PHA刺激外周血培养，只能获得正常淋巴细胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。

②动物骨髓细胞具有数量多且分裂旺盛的特点,可以直接利用其进行染色体标本的制备,这种方法具有方便快捷、不需体外培养和无菌操作,并且可以真实地反映完整机体所受环境影响的优点,常用于环境中致畸、致突变因素的检测和小型动物染色体的研究,在临床上也常用于白血病、多发性骨髓瘤等恶性血液病的研究。

③随着染色体制备技术和观察方法的建立，人类医学细胞遗传学迅速发展。诸多染色体病的发现和七十年代显带技术及八十年代染色体高分辨技术的出现和在染色体病研究中的应用，加速了细胞遗传学的发展，并促使了细胞分子遗传学这一学科的形成和临床应用。染色体原位杂交技术及间期细胞遗传学的发展为人们研究染色体病提供了更为有效的手段。生物化学理论和研究手段的不断发展，使生化遗传学得以迅速成长。DNA双螺旋结构和阐明和基因检测手段的出现，奠定了现代医学分子遗传学的基础。七十年代开始出现和发展的分子生物学技术在医学遗传学研究中的应用，大大的加快了医学遗传学的发展步伐，使医学遗传学研究进入了一个崭新的时期，一大批遗传病的发病本质从基因水平得以阐明，基因诊断和产前基因诊断迅速发展并在临床上广泛推广应用，并为基因治疗奠定了基础。

④还可用于产前诊断（如羊水细胞染色体制备分析是目前确诊胎儿是否有染色体疾病的较为完全可靠及常用的检查方法），异常染色体的检出对患者的治疗、预后及优生、优育、优教都有重要的指导意义。