实验一 DNA重组技术简介
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方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋 白既不能测定生物活性， 又无现成的抗体使用，则 可采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳进行粗略的筛选
一、课程介绍
• 36学时，2学分 • 参考教材：《分子生物学实验指导》 • 参考资料： 《分子克隆实验指南（第三版）》
大规模生产生物活性物质
天天然然细细胞胞
分分离离工工程程
分分
离离
酶酶
工工
程程
酶酶工工程程
天天然然细细胞胞
基基因因工工程程 蛋蛋白白质质工工程程 途途径径工工程程
工工程程细细胞胞
发发酵酵工工程程 细细胞胞工工程程
生生物物活活性性物物质质
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
原位杂交 Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
抗
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须
药插
借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组
性入
子与非重组子、目的重组子与非目的重组子
标失 记活
选法
择
转化子
重组子
目的重组子
)
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
促进组氨酸合成
基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA技术。
目的 ① 分离获得某一目的基因或DNA ② 获得目的基因的表达产物（蛋白质）
1
C 重组DNA技术与基因工程的基本用途
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15ºC
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性内切酶－基因的剪刀
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G
+ GATCC
CCTAG
G
2
连接酶－基因工程的针线
（三）目的基因
重组DNA技术
DNA Recombination Technique
现代美人鱼的诞生－基因重组
1972年，美国斯坦福大学的Berg在 体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌 体的DNA分别进行酶切消化，然后再 用T4 DNA连接酶将两种消化片段连接 起来，结果获得了包括SV40和λDNA 的重组的杂交DNA分子。
6
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)
导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法
4
PCR的反应体系
模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。
PCR的基本反应步骤及原理
（1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结
合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种
dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互 补的DNA新链。
T(TA)(AnT) nA
15ºC
AT(A(T) )nAnT
重组体
4. 人工接头(linker)连接
由平端加上带有新的酶切位点的接 头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进 行粘端连接。
人
工
接
头
及
其
应
Байду номын сангаас
Eco RⅠ
用
Eco RⅠ
5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
Eco RⅠ Eco RⅠ
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达
3
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨
基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library)
1973年，斯坦福大学的Cohen等人 将编码有卡那霉素抗性基因的质粒与 编码有四环素抗性基因的另一种大肠 杆菌质粒重组后，得到了既抗卡那霉 素又抗四环素的重组体。
1 基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途
A 重组DNA技术的基本定义
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′ 聚合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3′末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
PCR反应条件
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接
同
一
GGATCC
Bam HⅠ切割反应
限
CCTAGG
制
酶
G
GATCC
切
CCTAG
G
位
点
目的基因用 Bam HⅠ切割
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´ A(A)nA
目的基因
限制酶或机械剪切 3´ 5´
λ-核酸外切酶
3´ 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´
载体DNA
限制酶
5´
3´
3´
5´
λ-核酸外切酶
5´ 3´
5´ 3´ T(T)nT
3´ 5´ 末端转移酶 + dTTP
T(T)nT 3´ 5´
T4 DNA连接酶
3. cDNA文库(cDNA library)
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,
PCR)
1. 化学合成法
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
2. 基因组DNA文库
组织或细胞染色体DNA
存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
限制性内切酶 基因片段
《精编分子生物学实验指南》
• 成绩评定：总分100分，平时成绩占30％＋操作考试 成绩占30％＋期末笔试成绩占40％
第2周 第14周
二、教学进度
实验准备和LB培养基的配制、灭菌等 质粒DNA的提取
琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 质粒DNA的酶切及鉴定 酶切产物的纯化 PCR扩增 PCR扩增产物鉴定及纯化
• cDNA (complementary DNA) • 基因组DNA (genomic DNA)
（四）基因载体
定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达
有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
λDNA 重组体
标 志 补 救
显色筛选法
显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可 区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上 携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生 颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质 粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌 质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
不宜表达真核基因组DNA
不能加工表达的真核蛋白质
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion
body) 很难表达大量可溶性蛋白
2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累
缺点：操作技术难、费时、费钱
转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程
7
载体遗传标记检测
α 互
显色筛选法
补
显色筛选法的基本操作：
的
lacZ'
检
将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基
ori pUC18
测
因内部，使之灭活，此时重组子呈Aprr、
Apr
lacZ--， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈
Aprr、lacZ++，蓝色菌落
AApp ++ XX--ggaall
大肠杆菌感受态细胞的制备 DNA重组与转化
重组子的鉴定：操作考试 外源基因的诱导表达 蛋白的电泳鉴定
2月份 3月份 4月份 5月份
三、实验内容总体安排
提取质粒 DNA
琼脂糖凝胶 电泳检测质 粒DNA
质 粒 DNA 的酶切及 鉴定
酶切产物 的纯化
实 验 准 备 和 质 粒 DNA 提取试剂的配制
质 粒 DNA 的 提取操作过程
意设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译
成多肽链而特意设计的载体称为表达载 体。
质粒 (plasmid)
细菌染色体外 的小型环状双链 DNA分子。
特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗
传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
二、重组DNA技术基本原理
载体DNA用Bam HⅠ切割
连 接
G
GATCC
+ CCTAG
G
G
GATCC
CCTAG
G
T4 DNA连接酶
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
载体自连
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
配伍末端的
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
5
2. 平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序 列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
（六）克隆基因的表达
表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化
8
1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）
标准：选择标志 强启动子
翻译调控序列
多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表 达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大 基本元件。
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到 基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的 分离纯化过程。
克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
3. cDNA文库 mRNA 反转录酶 cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌
cDNA文库
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
4. 聚合酶链反应（PCR）
是一种在体外利用酶促反应大量获 得特异序列的基因组DNA或cDNA的专 门技术，又称为无细胞的分子克隆。
重重组组子子（（AApprr ++ llaaccZZ--））
小结
重组DNA技术操作过程可形象归纳为
分
分离目的基因
切
限制酶切目的基因与载体
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
切
接
转
增 检
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋 白既不能测定生物活性， 又无现成的抗体使用，则 可采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳进行粗略的筛选
一、课程介绍
• 36学时，2学分 • 参考教材：《分子生物学实验指导》 • 参考资料： 《分子克隆实验指南（第三版）》
大规模生产生物活性物质
天天然然细细胞胞
分分离离工工程程
分分
离离
酶酶
工工
程程
酶酶工工程程
天天然然细细胞胞
基基因因工工程程 蛋蛋白白质质工工程程 途途径径工工程程
工工程程细细胞胞
发发酵酵工工程程 细细胞胞工工程程
生生物物活活性性物物质质
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
原位杂交 Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
抗
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须
药插
借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组
性入
子与非重组子、目的重组子与非目的重组子
标失 记活
选法
择
转化子
重组子
目的重组子
)
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
促进组氨酸合成
基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA技术。
目的 ① 分离获得某一目的基因或DNA ② 获得目的基因的表达产物（蛋白质）
1
C 重组DNA技术与基因工程的基本用途
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15ºC
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性内切酶－基因的剪刀
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G
+ GATCC
CCTAG
G
2
连接酶－基因工程的针线
（三）目的基因
重组DNA技术
DNA Recombination Technique
现代美人鱼的诞生－基因重组
1972年，美国斯坦福大学的Berg在 体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌 体的DNA分别进行酶切消化，然后再 用T4 DNA连接酶将两种消化片段连接 起来，结果获得了包括SV40和λDNA 的重组的杂交DNA分子。
6
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)
导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法
4
PCR的反应体系
模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。
PCR的基本反应步骤及原理
（1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结
合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种
dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互 补的DNA新链。
T(TA)(AnT) nA
15ºC
AT(A(T) )nAnT
重组体
4. 人工接头(linker)连接
由平端加上带有新的酶切位点的接 头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进 行粘端连接。
人
工
接
头
及
其
应
Байду номын сангаас
Eco RⅠ
用
Eco RⅠ
5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
Eco RⅠ Eco RⅠ
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达
3
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨
基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library)
1973年，斯坦福大学的Cohen等人 将编码有卡那霉素抗性基因的质粒与 编码有四环素抗性基因的另一种大肠 杆菌质粒重组后，得到了既抗卡那霉 素又抗四环素的重组体。
1 基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途
A 重组DNA技术的基本定义
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′ 聚合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3′末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
PCR反应条件
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接
同
一
GGATCC
Bam HⅠ切割反应
限
CCTAGG
制
酶
G
GATCC
切
CCTAG
G
位
点
目的基因用 Bam HⅠ切割
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´ A(A)nA
目的基因
限制酶或机械剪切 3´ 5´
λ-核酸外切酶
3´ 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´
载体DNA
限制酶
5´
3´
3´
5´
λ-核酸外切酶
5´ 3´
5´ 3´ T(T)nT
3´ 5´ 末端转移酶 + dTTP
T(T)nT 3´ 5´
T4 DNA连接酶
3. cDNA文库(cDNA library)
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,
PCR)
1. 化学合成法
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
2. 基因组DNA文库
组织或细胞染色体DNA
存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
限制性内切酶 基因片段
《精编分子生物学实验指南》
• 成绩评定：总分100分，平时成绩占30％＋操作考试 成绩占30％＋期末笔试成绩占40％
第2周 第14周
二、教学进度
实验准备和LB培养基的配制、灭菌等 质粒DNA的提取
琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 质粒DNA的酶切及鉴定 酶切产物的纯化 PCR扩增 PCR扩增产物鉴定及纯化
• cDNA (complementary DNA) • 基因组DNA (genomic DNA)
（四）基因载体
定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达
有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
λDNA 重组体
标 志 补 救
显色筛选法
显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可 区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上 携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生 颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质 粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌 质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
不宜表达真核基因组DNA
不能加工表达的真核蛋白质
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion
body) 很难表达大量可溶性蛋白
2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累
缺点：操作技术难、费时、费钱
转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程
7
载体遗传标记检测
α 互
显色筛选法
补
显色筛选法的基本操作：
的
lacZ'
检
将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基
ori pUC18
测
因内部，使之灭活，此时重组子呈Aprr、
Apr
lacZ--， 淡 黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈
Aprr、lacZ++，蓝色菌落
AApp ++ XX--ggaall
大肠杆菌感受态细胞的制备 DNA重组与转化
重组子的鉴定：操作考试 外源基因的诱导表达 蛋白的电泳鉴定
2月份 3月份 4月份 5月份
三、实验内容总体安排
提取质粒 DNA
琼脂糖凝胶 电泳检测质 粒DNA
质 粒 DNA 的酶切及 鉴定
酶切产物 的纯化
实 验 准 备 和 质 粒 DNA 提取试剂的配制
质 粒 DNA 的 提取操作过程
意设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译
成多肽链而特意设计的载体称为表达载 体。
质粒 (plasmid)
细菌染色体外 的小型环状双链 DNA分子。
特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗
传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
二、重组DNA技术基本原理
载体DNA用Bam HⅠ切割
连 接
G
GATCC
+ CCTAG
G
G
GATCC
CCTAG
G
T4 DNA连接酶
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
载体自连
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
配伍末端的
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
5
2. 平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序 列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
（六）克隆基因的表达
表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化
8
1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）
标准：选择标志 强启动子
翻译调控序列
多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表 达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大 基本元件。
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到 基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的 分离纯化过程。
克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
3. cDNA文库 mRNA 反转录酶 cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌
cDNA文库
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
4. 聚合酶链反应（PCR）
是一种在体外利用酶促反应大量获 得特异序列的基因组DNA或cDNA的专 门技术，又称为无细胞的分子克隆。
重重组组子子（（AApprr ++ llaaccZZ--））
小结
重组DNA技术操作过程可形象归纳为
分
分离目的基因
切
限制酶切目的基因与载体
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
切
接
转
增 检
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物