真菌产3种β-D-Glucuronidase酶学性质
β—葡萄糖苷酶及其应用
β—葡萄糖苷酶及其应用β—葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种重要的酶类，在生物化工、医药、食品工业等领域有着广泛的应用。
它主要能够催化β-葡萄糖苷键的水解反应，将底物分子中的β-葡萄糖苷键水解为葡萄糖和另一种化合物。
β—葡萄糖苷酶的广泛应用使得其在工业生产中具有重要的地位，同时也在生命科学领域中具有深远的影响。
本文将就β—葡萄糖苷酶的结构特点、生物学功能以及在工业和生命科学领域中的应用进行详细的阐述。
β—葡萄糖苷酶在结构上属于多种酶类，包括α折叠酶家族（α/β）8酶家族、糖酶家族、糖苷酶家族等。
它们都是由多个多肽链组成的酶蛋白，并在功能上体现出对β-葡萄糖苷键具有特异性的水解作用。
β—葡萄糖苷酶的活性部位通常由一个或多个特定的氨基酸残基组成，形成了催化反应的中心。
β—葡萄糖苷酶的结构和特定的氨基酸序列也非常重要，它们决定了酶的催化活性和稳定性。
β—葡萄糖苷酶的生物学功能主要是参与碳水化合物代谢和降解过程。
在细胞内，β—葡萄糖苷酶可以分解底物中的β-葡萄糖苷键，释放出葡萄糖和其他有机物。
这一过程在生物体内起着至关重要的作用，影响着生物体对碳水化合物的吸收和利用。
β—葡萄糖苷酶还能够帮助细胞对植物细胞壁中的纤维素等多糖物质进行分解，释放出可被利用的糖类物质。
在工业领域，β—葡萄糖苷酶具有广泛的应用前景。
它可以用于生物质纤维素的降解和转化，从而提高生物质资源的利用率。
目前，生物质能源的研究已成为国际上的一个热点，而β—葡萄糖苷酶的应用则被认为是生物质能源开发的重要一环。
β—葡萄糖苷酶还可以用于食品工业中，通过降解植物细胞壁中的纤维素和半纤维素，从而提高食品加工的效率和产品的营养价值。
β—葡萄糖苷酶在医药领域也有重要的应用，比如可以用于制备抗肿瘤药物、抗生素和抗病毒药物等。
在生命科学领域，β—葡萄糖苷酶的研究也具有重要的意义。
它在细胞生物学、分子生物学和遗传工程等领域有着广泛的应用价值。
利用β—葡萄糖苷酶可以对细胞内的碳水化合物代谢过程进行研究，以揭示细胞内代谢通路的调控机制。
β—葡萄糖苷酶及其应用
β—葡萄糖苷酶及其应用β—葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种重要的酶类，在生物化学、生物技术、医学和工业中都有广泛的应用。
β—葡萄糖苷酶作用于葡萄糖苷键，能够水解葡萄糖苷化合物，将其转化为葡萄糖和相应的醛或酮。
本文将介绍β—葡萄糖苷酶的性质、结构、应用以及其在生物工程领域的潜力。
β—葡萄糖苷酶是一种水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物中。
在微生物中，β—葡萄糖苷酶在纤维素降解、半乳糖代谢以及多糖分解等生理过程中起着重要作用。
在植物中，β—葡萄糖苷酶参与了植物生长发育、种子萌发和植物抵抗逆境的过程。
在动物中，β—葡萄糖苷酶则参与了碳水化合物的代谢和营养吸收。
由于β—葡萄糖苷酶在生物体内起着重要作用，因此其在医药和食品工业中具有重要的应用价值。
β—葡萄糖苷酶通常被用于食品加工工业中，用于水解植物中的葡萄糖苷化合物，例如大豆异黄酮和花青素。
通过β—葡萄糖苷酶的作用，可以将这些化合物水解成为葡萄糖和其他生物活性物质，从而提高其生物利用率。
β—葡萄糖苷酶还被广泛用于啤酒、葡萄酒和果汁等酿造行业，帮助降解残留的酚类化合物，改善产品的口感和质量。
在医药领域，β—葡萄糖苷酶也具有重要的应用价值。
近年来，β—葡萄糖苷酶在抗癌药物的研发和生产中得到了广泛的应用。
一些天然产生的抗癌化合物以葡萄糖苷化合物的形式存在，通过β—葡萄糖苷酶的水解作用，可以将其转化为活性的抗癌物质，从而提高药物的疗效。
β—葡萄糖苷酶还被用于合成具有生物活性的化合物，为药物研发提供了有效的手段。
在生物工程领域，β—葡萄糖苷酶的潜力尤为巨大。
由于其具有水解葡萄糖苷化合物的特性，β—葡萄糖苷酶可以用于生物燃料的生产。
利用β—葡萄糖苷酶将植物细胞壁中的纤维素水解为葡萄糖，然后利用发酵工艺将葡萄糖转化为生物燃料，可以提高生物燃料的产量和质量，从而减缓对传统石化燃料的依赖。
β—葡萄糖苷酶还可以用于生物质降解和生物制药等领域，为生物工程技术的发展提供了强大的支持。
β葡萄糖醛酸酶水解条件
β葡萄糖醛酸酶水解条件
β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase）是一种水解酶，可以将葡
萄糖醛酸（GlcUA）从化合物中水解出来。
水解条件可以根据
具体的实验目的来确定，但一般需要满足以下条件：
1. pH：β-葡萄糖醛酸酶在中性或弱碱性条件下最活跃，pH范
围一般在6.5-8.5之间。
在不同的实验设置中，选择最适宜的
pH值进行反应，可以提高酶的活性和反应速率。
2. 温度：β-葡萄糖醛酸酶的最适温度一般在37°C左右。
根据
实验需要，可以在较低或较高温度下进行反应。
较低温度可以减缓反应速率，利于分析和观察结果；较高温度可以加快反应速率，缩短反应时间。
3. 存活因子：β-葡萄糖醛酸酶的活性受到一些辅助因子的影响，例如金属离子（如镁离子）、辅酶（如辅酶A）等。
根据实验所需，可以添加这些活性辅助因子来提高酶的活性。
4. 反应时间：β-葡萄糖醛酸酶的反应时间可以根据实验目的来
确定。
一般情况下，需要将样品与酶在适宜的pH和温度条件
下反应一段时间，以确保酶能够充分地水解目标物质。
需要注意的是，β-葡萄糖醛酸酶的水解条件可能因不同的实验
目的、反应物和实验设置而有所差异，因此在具体实验中需根据需要进行优化和调整。
β-葡萄糖醛酸苷水解酶简介
β-glucuronidase
β-葡萄糖醛酸苷水解酶是糖苷酶家族中的一员，人体β-葡萄糖醛酸苷水解酶含有653个氨基酸，相对分子量在80KD。
β-葡萄糖醛酸苷水解酶是溶酶体内的酸性水解酶，主要来源于多形核白细胞，也可见于其他细胞和细菌，是细胞外基质主要成分大分子蛋白聚糖降解的酶原之一，直接参与蛋白聚糖和细胞内外基质的降解过程。
β-葡萄糖醛酸苷水解酶具有多种特征结构，决定了其水解活性，包括由氢键连接而成的封闭桶状结构，以及由8个α螺旋体和8个平行的β折叠体组成的保守蛋白结构。
其广泛存在人体组织及体液中，参与内体多方面的调节。
如在肠道中，刷状边缘上的β-葡萄糖醛酸苷水解酶可以使结合型胆红素转变为非结合型胆红素，达到重吸收的作用。
β-葡萄糖醛酸苷水解酶同样存在于母乳中，与新生儿黄疸有密切的关系。
β-葡萄糖苷酶的研究进展
化工能源化 工 设 计 通 讯Chemical EnergyChemical Engineering Design Communications·144·第47卷第2期2021年2月β-葡萄糖苷酶也称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，其可以水解释放出β-D-葡萄糖及相关配基。
1837年研究人员在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，随后研究调查得出β-葡萄糖苷酶在植物和昆虫及细菌体内广泛存在，β-葡萄糖苷酶参与了生物体内的糖代谢过程，对维持生物正常的生理功能有重要作用。
β-葡萄糖苷酶参与EMP 糖酵解的途径属于参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系。
哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷（LPH ）水解酶也包含着芳基-β-葡萄糖苷酶，乳糖酶/根皮苷由于涉及成人型乳糖酶缺乏病得到广泛实验研究，同时β-葡萄糖苷酶可以使得水果和蔬菜及茶叶中的风味前体物质水解为有浓郁天然风味的香气物质，可以协助纤维素酶降解纤维素[1]。
1 β-葡萄糖苷酶简介β-葡萄糖苷酶分布比较广泛，普遍存在于植物的种子和微生物中，动物中也存在着大量的β-葡萄糖苷酶，根据酶对底物水解所具有的专一性特点，β-葡萄糖苷酶主要有芳香基-β-葡萄糖苷酶和烃基-β-葡萄糖苷酶及多底物特异性β-葡萄糖苷酶三种类型。
根据酶的结构和催化结构域的氨基酸序列等特点对其分类时，糖苷水解酶的GH1和GH3家族中所包含着的β-葡萄糖苷酶最多[2]。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶当中不可缺少的重要方面，随着时代的进步发展，像目前我国的医疗、食品乃至其他行业领域内，都有β-葡萄糖苷酶的应用身影。
最为关键的是，在我国经济等方面迅速发展的基础上，所带来了环境污染问题，鉴于严重的环境能源危机下，社会各界人士对β-葡萄糖苷酶提出了极高的关注程度。
通过实际调查发现，在对β-葡萄糖苷酶实施水解过程中，还存在的很大的困难就是纤维素彻底降解为单糖。
站在基因工程与蛋白质工程视角下进行分析，已经获取到了良好的β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶机理
β-葡萄糖苷酶是一种酶类蛋白质，它能够催化β-葡萄糖苷类化合物的水解反应。
其机理如下：
1.底物结合：β-葡萄糖苷酶首先与底物结合，形成酶-底物复合物。
酶的活性中心通常包含一个酸性残基和一个碱性残基，它们能够与底物中的葡萄糖分子中的糖苷键形成氢键和范德华力。
2.催化反应：在酸性条件下，β-葡萄糖苷酶的酸性残基能够使底物中的糖苷键断裂，产生葡萄糖和糖基。
3.产物释放：产物从酶分子上解离，并被释放出来。
需要注意的是，β-葡萄糖苷酶的催化机理是通过酸催化实现的。
因此，在不同的pH条件下，酶的催化效率和特异性可能会发生变化。
此外，β-葡萄糖苷酶还具有底物选择性，只能催化特定类型的糖苷键水解反应。
真菌(1-3)-D葡聚糖检测反应机理之欧阳语创编
真菌(1-3)--D葡聚糖检测反应机理时间：2021.03.01 创作：欧阳语目前临床上随着广谱抗生素、各类免疫抑制剂、移植插管等新技术的不断发展应用,其真菌感染尤其是深部真菌感染出现明显上升趋势,而作为临床诊断的细菌培养其阳性率很低,且检测周期长,不能适应临床治疗诊断的要求,因此迫切需要快速、准确的检测方法.因此对血液中的早期(1-3)--D葡聚糖快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中(1-3)--D葡聚糖快速检测对早期诊断深部真菌感染具有重要的参考价值。
该试验的基本原理是试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量(1-3)--D葡聚糖能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应,通过测定凝集反应过程中的浊度变化从而定量检测血浆中(1-3)--D葡聚糖含量.内毒素定量检测的反应机理细菌内毒素作为革兰阴性菌细胞壁外层中的脂多糖成份(LPS), 具有多种的生物活性, 微量的内毒素进入机体将会出现发热、血压降低、寒战、引起DIC、内毒素败血症等一系列临床反应, 因此对血液中的早期内毒素快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中内毒素检测对分别诊断革兰阴性杆菌感染具有重要的参考价值。
反应试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量革蓝氏阴性菌内毒素能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应形成凝胶,通过测定在形成凝胶过程中的浊度变化从而定量检测血浆中革蓝氏阴性菌内毒素.一、检测体液内毒素的临床意义由革兰氏阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症是目前临床上的主要死亡原因之一。
在各类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的同时，也会使后者释放出一定数量的内毒素，从而加重内毒素血症。
早期诊断的细菌学培养需时长，而且由于抗生素的应用，其培养阳性率低。
早期的数小时内作为临床上抢救感染性休克的关键，临床医师仅能根据临床特征与体征推断病源学而带有一定的盲目性，因此，早期体液中内毒素的正确、快速定量检测及相应的对症治疗就显得格外重要。
β-葡萄糖醛酸苷酶 葡萄糖苷酶
β-葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖苷酶β-葡萄糖醛酸苷酶与葡萄糖苷酶是两种重要的酶类，它们在生物体内发挥着关键的作用。
本文将介绍这两种酶的功能、特点以及在生物学和医学领域中的应用。
β-葡萄糖醛酸苷酶是一种能够催化β-葡萄糖醛酸苷水解为葡萄糖和醛酸的酶。
它主要存在于细胞质中，参与多种代谢途径。
β-葡萄糖醛酸苷是一种重要的代谢产物，它在维持细胞内能量平衡、碳水化合物代谢以及抗氧化等方面发挥着重要作用。
β-葡萄糖醛酸苷水解为葡萄糖和醛酸后，可以进一步参与到其他代谢途径中，如糖原合成、能量产生等。
与之相对应的是葡萄糖苷酶，它是一类能够催化葡萄糖苷水解为葡萄糖和其他官能团的酶。
葡萄糖苷是一种广泛存在于生物体内的化合物，它在多种生物过程中发挥着重要作用。
葡萄糖苷酶能够将葡萄糖苷水解为葡萄糖和其他官能团，这些产物可以进一步参与到细胞代谢中，如能量产生、信号传导等。
β-葡萄糖醛酸苷酶和葡萄糖苷酶在生物学和医学领域中有着广泛的应用。
首先，在食品工业中，这两种酶可以用于食品加工过程中的改良和改进。
例如，在果汁加工过程中，添加适量的β-葡萄糖醛酸苷酶可以降低果汁的粘度，提高其流动性；而添加适量的葡萄糖苷酶则可以提高果汁的甜度和口感。
其次，在医学领域中，这两种酶也有着重要的应用价值。
β-葡萄糖醛酸苷水解产生的葡萄糖和醛酸在糖尿病治疗中有着重要作用。
葡萄糖苷酶则可以用于某些遗传代谢病的诊断和治疗。
例如，葡萄糖苷酶缺乏症是一种罕见的遗传代谢病，患者体内缺乏葡萄糖苷酶，导致葡萄糖苷无法正常代谢。
通过检测患者体内的葡萄糖苷酶活性，可以帮助医生进行准确的诊断，并制定相应的治疗方案。
综上所述，β-葡萄糖醛酸苷酶和葡萄糖苷酶是两种重要的酶类，在生物体内发挥着关键作用。
它们不仅参与到细胞代谢中，维持生物体内能量平衡和碳水化合物代谢等方面，还在食品工业和医学领域中有着广泛的应用价值。
对这两种酶的深入了解和应用将有助于推动相关领域的发展和进步。
葡萄糖氧化酶.
动物营养学方面：中国农业科学院畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室 和北京市饲料监察所的邢焕，孙春阳，栾素军，萨仁娜，张宏福，丁美芳六位 导师在2015年4月15日发表了题名为《葡萄糖氧化酶和酵母硒混合添加剂对肉 鸡生产性能和免疫指标的影响》的文章，本文旨在研究以葡萄糖氧化酶和酵母 硒为主要成分的混合添加剂,在规模化养殖条件下,对肉鸡生产性能、免疫器官 指数和血清蛋白指标的影响。将5 000只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡,随机分为2个 组,分别为对照组和试验组,每个组设4个重复,每个重复625只鸡。对照组饲喂玉 米-豆粕基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+0.2%混合添加剂(葡萄糖氧化酶和酵母 硒)。试验期为42 d。结果表明,1)生产性能:在肉鸡不同日龄阶段(1~21日龄、 22~42日龄和1~42日龄),试验组的平均日采食量 (ADFI) 、平均日增重(ADG) 均 显著高于对照组(P<0.05),ADFI分别提高了2.58%、1.55%和1.83%,ADG分别提 高了1.67%、6.93%和6.66%;试验组料重比(F/G)显著低于对照组(P<0.05),分别 降低了3.36%、5.13%和4.44%。在肉鸡生长全期(1~42日龄),试验组肉鸡死亡 率显著低于对照组(P<0.05)。
直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖 氧化酶，并研究了其催化机理才正式将其命名为葡萄糖氧化酶，将其 归入脱氢酶类。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后对此做了 大量研究工作并投入生产。中国从20世纪70年代开始成立了葡萄糖氧 化酶研究协作组，对其展开了系统研究工作。目前国外的葡萄糖氧化 酶生产厂家主要是德国的Boehringer和日本的Toyobo。近年来国内外 多位学者对葡萄糖氧化酶的作用机理、酶学性质、酶固定化、基因克 隆表达等方面做了大量工作取得了明显进展。
β-葡聚糖酶
植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。
20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。
目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。
1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。
它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。
它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。
各种类型的β-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。
根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。
I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。
碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。
现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。
在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。
受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin ／cytokine所抑制，并受发育的调节。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第５卷第２期 ２００７年５月 生物加工过程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍａｙ ２００７
・ ｌ７ ・
真菌产３种／３一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ 酶学性质 王小艳 ，冯世江 ，文先军 ，李 晖 ，李 春 （１．石河子大学 绿色合成与转化实验室，石河子８３２００３； ２．北京理工大学 生命科学与技术学院，北京１０００８１）
摘要：分离筛选到能代谢甘草酸并产生不同产物的３株菌株，其中Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３转化甘草酸生成ＧＡＭＧ，Ａｓ— ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０生成ＧＡＭＧ和甘草次酸，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２生成甘草次酸。对这３株菌表达 一Ｄ一葡萄糖醛酸苷 酶的酶学性质进行了研究，结果表明：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３、』４ ｅｒｇ 淞ｓｐ．Ｌｉ－２０和』４ ｅｒｇ ｓｐ．Ｌｉ一６２卢一Ｄ一葡萄糖醛酸 苷酶最适催化ｐＨ分别为４．２～４．６，５．８和６．２，最适催化温度为５Ｏ、４５和５５℃。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３表达的 一Ｄ一葡 萄糖醛酸苷酶 为０．３２８ ｏＬ／Ｌ，Ｖｍ 为０．００３ ５ ｍｍｏＬ／（Ｌ・ｍｉｎ）；Ａ ｅｒｇ ｓｐ．Ｌｉ－２０ 一Ｄ一葡萄糖醛酸苷酶 为 ３．６１ ｍｍｏ］／Ｌ，Ｖｍ 为０．０３４ ｍｍｏＬ／（Ｌ・ｍｉｎ）；而Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ 一Ｄ一葡萄糖醛酸苷酶 为０．４３ ｍｍｏｌ／Ｌ， 为 ０．１０６ ｍｍｏＬ／（Ｌ・ｍｉｎ）。 关键词： 一Ｄ．Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；酶学性质；多样性；甘草酸 中图分类号：ＴＱ９２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—３６７８（２００７）０２—００１７—０６
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｌ３｝一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｆｕｎｇｉ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｙａｎ ，ＦＥＮＧ Ｓｈｉ－ｊｉａｎｇ ，ＷＥＮ Ｘｉａｎ－ｊｕｎ ，ＬＩ Ｈｕｉ ，ＬＩ Ｃｈｕｎ ， （１．Ｌａｂ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２００３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ卢一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｓｔｏｎ— ｉｎｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３ Ｂ— Ｄ．ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｗａｓ ｐＨ ４．２ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ５０℃，ｔｈｅ Ｋ ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．３２８ Ｉ．￣ｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ０．００３ ５ ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０ 一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｗａｓ ｐＨ ５．８ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ４５℃，ｔｈｅ Ｋ ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅａｃ— ｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ３．６１ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ０．０３４ ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ０ｐ— ｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２口一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｗａｓ ｐＨ ６．２ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ５５℃，ｔｈｅ Ｋ ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．４３ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ０．１０６ ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：口一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ
甘草酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ，ＧＬ）是一种重要的天然甜 味剂和药物，但会导致人体内钠排出减少而钾排出 增加，产生一定的副作用…。甘草酸生物转化后的
产物单葡糖醛酸基甘草次酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｍ０ｎ０ｇｌｕｃｕｒ０ｎｉｄｅ，ＧＡＭＧ）（转化原理见图１）的甜度 是蔗糖的１ ０００多倍，是一种高甜度低热量的天然功
收稿日期：２００６—１１—１９ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０４６６００２）；新世纪优秀人才支持计划资助项目（ＮＣＥＴ－０４－０９８９）；北京市自然科学基金资助项 目ｆ５０７２０２８） 作者简介：王小艳（１９８０一），女，四川蓬溪人，硕士研究生，研究方向：生物催化与酶工程。 联系人：李春，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｃｈｕｎ０４＠ｂｉｔ．ｅｄｕ．ＣＩＩ
维普资讯 http://www.cqvip.com ・ １８ ・ 生物加工过程 第５卷第２期 能性甜味剂；ＧＡＭＧ作为药物具有和甘草酸同样的 抗炎症、抗病毒等疗效。而甘草次酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＧＡ）是甘草酸生物转化后的另一活性物质（转 化原理见图１），是生物体直接吸收利用的活性成 ＧＬ ００Ｈ 分，具有与甘草酸同样的药理作用 ，同时，可以利 用甘草次酸为底物生成更具药用价值的甘草次酸 类衍生物。
０Ｈ ０Ｈ ＧＬ ００Ｈ 图１生物合成ＧＡＭＧ和ＧＡ的原理 Ｆｉｇ．１ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ＧＡＭＧ ａｎｄ ＧＡ 目前，ＪＢ．Ｄ．葡萄糖醛酸苷酶（卢－Ｄ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉ－ ｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．３１）作为报告基因已广泛应用于高 等植物的分子克隆，饮用水和食品中Ｅ．ｃｏｌｉ的检 验，同时该酶还可被用于肿瘤的前体药酶导向治疗 方面 』。而不同生物中的ＪＢ．Ｄ．Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ作为催 化剂在甘草酸的转化中具有以下４种催化特性 ： （１）甘草酸一甘草次酸；（２）甘草酸— －Ｄ－单葡萄糖 醛酸基甘草次酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｇｌｕｃｕ－ ｒｏｎｉｄｅ，ＧＡＭＧ）一甘草次酸；（３）甘草酸一ＧＡＭＧ； （４）ＧＡＭＧ一甘草次酸。因此，国外学者认为该酶 具有外切式和内切式水解酶之分 ，然而至今无相 关文献予以详细阐述。 本实验室自行筛选获得３株菌：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ５ｐ．Ｌｉ－３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０和Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２催 化甘草酸分别生成ＧＡＭＧ、ＧＡＭＧ和甘草次酸、甘草 次酸。因此，本文研究了来自不同微生物中ＪＢ－Ｄ－ Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ的酶学性质，从催化甘草酸形成产物 多样性的角度对 －Ｄ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ进行分析。 １材料与方法 １．１ 菌株 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｉ５．３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０和 － ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２为北京理工大学生命科学与技术 学院生物催化研究室保存菌种。 １．２培养基与培养方法 参照文献［５—６］的方法。 １．３试剂 －Ｄ－单葡萄糖醛酸基甘草次酸标准品由南京工 业大学赠送，甘草酸单铵盐标准品和甘草次酸标准 ０ ＧＡ
Ｈ
品均购自Ｓｉｇｍａ公司，甘草酸单铵盐由新疆天山制 药有限公司提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分 析纯。 １．４代谢产物分析 薄层层析（ＴＬＣ）：标准品及摇瓶发酵液经离心 后的上清液在硅胶板（ＧＦ２５４，青岛海洋化工集团干 燥剂厂）上点样，在展开剂（Ｖ（ＢｕＯＨ）：Ｖ（ＣＨＣ１ ）： Ｖ（ＡｃＯＨ）：Ｖ（Ｈ：Ｏ）＝４：１：４：１）中展开约１３ ｃｍ后 取出晾干，在２５４ ｎｍ紫外灯下观察斑点。 １．５粗酶的制备 参照文献［５，７］的方法，其中Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ－ ３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０和Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２的ＪＢ－Ｄ－ Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ制备用的磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲液 （５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）的ｐＨ分别为４．２，５．８和６．２。 １．６ ＪＢ．Ｄ．Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ活力的测定 准确移取１ ｍＬ粗酶液加入到２ ｍＬ含有甘草酸 质量浓度２ ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ为５．４的磷酸氢二钠－柠檬 酸缓冲液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）中，４５℃条件下，反应３０ ｍｉｎ 后，沸水浴使酶失活，取０．５ ｍＬ反应液用甲醇定容 至１０ ｍＬ，样液进高效液相色谱仪检测，酶活以甘草 酸的消耗量表征。高效液相色谱仪的检测方法参 照文献［８—９］。
．Ｄ．Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ活力定义为在上述条件下， 每小时消耗１ ｔｘｇ的甘草酸所需要的酶量为一个活 力单位（Ｕ／ｍＬ）。
２结果与讨论 ２．１发酵产物多样性分析 以甘草酸为唯一碳源从新疆主要甘草产区的
维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年５月 王小艳等：真菌产３种 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ酶学性质 １９・ 土样中分离筛选到６５株代谢甘草酸的菌株，对初筛 的６５株菌进行摇瓶发酵，发酵液采用薄层层析 （ＴＬＣ）进行初步定性，进一步筛选得到了３株菌，并 通过显微镜鉴定，暂时命名为Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０和Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一６２。３株菌通 过ＴＬＣ和ＬＣ—ＭＳ检测分析发酵液，确定甘草酸代谢 后的产物分别为ＧＡＭＧ和甘草次酸，由于甘草酸、 ＧＡＭＧ和甘草次酸的极性是依次减弱，因此ＴＬＣ图 谱中甘草酸、ＧＡＭＧ和甘草次酸是依次出现斑点 （图２）。
ＧＡ ＧＡＭＧ
ＧＬ
１一甘草酸标准品；２一 ｎ ｆ ｕｍ ｓｐ．ＩＡ－３； ３－－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０；４— Ｐ “ｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ 图２ ３株菌摇瓶终点时发酵液ＴＬＣ检测结果 Ｆｉｇ．２ ＴＬＣ ｒｅｓｕｌｔ ｆｒｏｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ
从图２可知：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３菌株产 一Ｄ— Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ消耗利用甘草酸后的产物以ＧＡＭＧ 为主；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０ 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ代谢甘 草酸后的产物始终以ＧＡＭＧ和甘草次酸两种物质 存在；而Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ催化 甘草酸后的产物只有甘草次酸。３株菌表达的 一Ｄ— Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ在催化甘草酸后表现出生成产物的多 样性。 ２．２ ｐＨ对 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ活性及稳定性的影响 用ｐＨ为３．８，４．２，４．６，５．０，５．４，５．８，６．２，６．６， ７．０和７．４的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液分别配制 ２ ｍｇ／ｍＬ的甘草酸为底物，研究 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ 的最适反应ｐＨ，结果见图３。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３产 的 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ在ｐＨ ４．２～４．６范围内均保持 较高催化活力，最适ｐＨ值为４．２；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一 ２０ 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ在ｐＨ ４．６～６．６范围内酶活较 高，其最适ｐＨ为５．８；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ 一Ｄ—Ｇｌｕ— ｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ催化甘草酸反应的最适ｐＨ为６．２。 ！｝坚 豁 霞 ４ ｐＨ －－￣－－Ｐｅｎｉｃｉｌｌｌｕｍ ｓｐ．Ｌｉ－３；－－．－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０； －－－ｎ－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ 图３／３一Ｄ—Ｇｌｕｅｕｒｏｎｉｄａｓｅ最适反应ｐＨ Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｏｆ Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 用上述不同ｐＨ缓冲溶液配制的酶液在４ 条 件下放置２４ ｈ，研究酶的ｐＨ稳定性。结果见图４。 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３和Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２表达的 一 Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ均在ｐＨ ５．０～６．２范围内具有较好 稳定性，２４ ｈ后其催化活力均保持在初始值的６０％ 以上；而Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一２０ 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ在ｐＨ ４．６～７．０范围内具有较好的稳定性，２４ ｈ后剩余酶 活力均在初始值的８０％以上。３株菌表达的酶最 适反应ｐＨ与ｐＨ稳定性均有所不同，可能原因是３ 种催化类型菌株表达酶的结构是有差异的。 妲 鞋 ‘靛 ｐＨ －－０－Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ－３；－－．－－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－６２ ４ 图４／３一Ｄ—ＧｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｐＨ稳定性 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ／３一Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２．３ 温度对 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ活性及稳定性的 影响 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｌｉ一３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ－２０和Ａｓｐｅｒ— ｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌｉ一６２ 一Ｄ—Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ分别与用ｐＨ为 ４．２，５．８和６．２的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制的