离子交换层析的纯化原理
蛋白纯化离子交换层析
蛋白纯化离子交换层析离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。
离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。
常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。
例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。
强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类；在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。
根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。
一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。
离子交换层析 原理 步骤 详细
※带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来 ※带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来
三、操作注意点
（一）离子交换剂的选择
原则： 根据被分离物质的性质选择—同一性 质离子交换剂中选用对被分离物质各组 分之间结合力差异大的型号交换剂
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素
三、结果要求：
指出2个洗脱峰分别出现在几号管？
分别是哪个氨基酸？
弱酸型 羧基 阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱
叔胺、仲胺、伯胺基团
（4）离子交换树脂对离子的亲和力 ■ 离子取代顺序：
电荷高者
离子大者 浓度大者
++ +
+ + + + ++ + + + + + +
> > >
+ + +
（4）离子交换树脂对离子的亲和力
①阳离子树脂 + ++ +++<Ti++++ 电价数：Na <Ca <Al 原子价数相同，原子序数 Li+<Na+<K+<Pb+ ②阴离子 强碱性交换树脂 CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I<C2O4=<SO4= 弱碱性交换树脂 F-< CL-< Br-= I- =CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根< 柠檬酸根<C2O4=<SO4=<OH
离子交换层析名词解释
离子交换层析名词解释
离子交换层析（Ion exchange chromatography，简称IEC）是一种分析和分离离子的技术方法。
在离子交换层析中，样品溶液被注入到一个含有离子交换树脂的柱子中，离子交换树脂具有特定的离子交换基团，可以选择性地吸附和释放样品溶液中的离子。
离子交换层析的分离原理基于离子交换树脂对溶液中的离子的亲和力不同。
当样品溶液通过柱子时，带有相同电荷的离子与离子交换树脂产生吸附作用，而带有相反电荷的离子则可以自由通过。
通过调节溶液的pH值、离子浓度和离子交换树脂的性质，可以实现对不同离子的选择性分离。
离子交换层析常用于分离和纯化蛋白质、核酸和多肽等生物大分子，并且在药物研发、环境分析和生命科学研究中得到广泛应用。
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶0
三、试验材料与试剂 1、试验材料
蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、试验试剂 ⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子互换剂)； ⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液； ⑶ 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液(学生自配）； ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ； ⑸ 5%蔗糖溶液 ； ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂
7、蔗糖酶活力检测
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 5%蔗糖溶液 蒸馏水 分离纯化样品溶液
3.5－二硝基水杨酸试剂
蒸馏水 观察颜色
空白对照
样品管
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
1.0ml
0.9ml
/
0.1ml
50℃水浴10min
1.0ml
Байду номын сангаас
1.0ml
100℃水浴5min
5ml
5ml
搜集活力高旳蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存，用 于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于用正交 法测定几种原因对蔗糖酶活性旳影响（限定性设计试验）。样品低温－20℃ 保存。
停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相 切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加 入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽量保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶 液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少许洗脱缓冲液将残余在层析柱
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白
05 结论与展望
研究结论
DEAE-纤维素离子交换层析是一种有效的血清白蛋白纯化方法，具有高 分辨率和高回收率的特点。
通过优化实验条件，如流速、pH值和离子强度等，可以进一步提高血清 白蛋白的纯度和产量。
DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白的实验结果证明了该方法的 可行性和实用性，为大规模制备高纯度血清白蛋白提供了新的途径。
5. 洗脱
用不同浓度的NaCl溶液 进行洗脱，收集洗脱液。
6. 检测
用紫外可见分光光度计 和电导仪检测洗脱液中 血清白蛋白的纯度和含
量。
实验步骤
1. 准备实验试剂和仪 器。
3. 将DEAE-纤维素装 入层析柱。
2. 制备DEAE-纤维素 离子交换剂。
实验步骤
4. 用缓冲液平衡层析柱。 5. 将血清白蛋白样品加入层析柱。
实验方法
离子交换层析原理
利用DEAE-纤维素与血清白蛋白 之间的离子相互作用，通过改变 洗脱液的离子强度，将血清白蛋 白与其他杂质分离。
1. 样品处理
将血清白蛋白样品稀释至适当浓 度。
2. 装柱
将DEAE-纤维素装入层析柱中。
实验方法
3. 平衡
用缓冲液平衡层析柱。
4. 上样
将稀释后的血清白蛋白 样品加入层析柱。
分离和纯化核酸
核酸是生物遗传信息的载体，包括DNA和RNA。通过DEAE-纤维素离 子交换层析可以分离和纯化各种核酸，用于研究核酸的结构和功能以及 制备核酸制品。
03 实验材料与方法
实验材料
血清白蛋白样品
缓冲液：Tris-HCl、NaCl 等
DEAE-纤维素离子交换剂
洗脱液：不同浓度的 NaCl溶液
研究目的和意义
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。
离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。
离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。
1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。
几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。
目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。
2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。
平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。
平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
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离子交换层析的纯化原理
离子交换层析是一种常用的分离纯化技术，它基于离子交换作用原理，通过离子交换树脂将混合物中的离子进行吸附和释放，从而实现对目标离子的纯化。
离子交换层析在生物分子的分离纯化、水处理、药物纯化等领域具有广泛的应用。
离子交换层析的纯化原理包括离子的吸附和释放步骤，具体过程如下：
1. 吸附阶段：在离子交换层析中，选择具有离子交换基团的树脂作为固定相，常见的有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
在混合物中，选择性地吸附目标离子，其他离子则通过树脂层析柱。
当混合物溶液通过层析柱时，目标离子与离子交换基团发生静电作用，被吸附在树脂上。
吸附过程可通过控制pH值、离子浓度和离子交换柱的选择来实现。
2. 洗脱阶段：吸附在树脂上的目标离子可以通过改变溶液性质来实现释放。
这可以通过改变pH值、离子浓度或添加竞争性离子等方式来实现。
当采用酸性洗脱时，通过调节pH值，使目标离子与交换基团结合的静电作用减弱或破坏，从而使目标离子从树脂上解吸下来。
类似地，碱性条件下发生的酸洗脱也可以通过调节pH值实现目标离子的解吸。
此外，还有一些特殊洗脱方法，如温度调控法、浓度梯度洗脱法等。
离子交换层析的纯化原理主要包括两个方面：选择性吸附和静电作用。
1. 选择性吸附：离子交换树脂的交换基团具有特定的亲和性和选择性，可以选择性地吸附目标离子。
交换基团通常是带电的官能团，如硫酸树脂的交换基团为SO3-，对应着可吸附阳离子。
这些交换基团与离子之间通过静电作用或化学键形成吸附结合，从而实现离子的选择性吸附。
通过调节交换基团的类型和性质，可以选择性吸附不同类型的离子。
2. 静电作用：离子交换主要通过静电作用来实现离子与交换基团的结合和解离。
当目标离子与交换基团发生静电作用时，会产生电荷之间的相互作用力。
离子交换树脂通常带有正电荷或负电荷，吸附的离子通常与树脂的电荷相反。
当pH值适当时，离子交换层析系统中溶液中的目标离子与交换树脂之间会出现较大的静电吸引力，从而实现目标离子的吸附。
而当改变pH值或者添加竞争性离子时，可以破坏目标离子与交换树脂之间的静电相互作用，从而实现离子的解吸。
总结起来，离子交换层析的纯化原理是基于离子交换树脂具有特定的选择性吸附和静电作用。
通过对吸附阶段和洗脱阶段的控制，可以实现对混合物中目标离子的选择性吸附和纯化。
离子交换层析是一种有效的分离纯化技术，广泛应用于分析化学、生物化学、生物制药等领域。