离子交换层析配基、基架、填料
层析填料介绍
层析填料介绍
一、离子交换层析柱
1. 弱阳离子交换填料：以羧基为主，常用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
2. 强阳离子交换填料：以氨基为主，常用于有机物、生物小分子、金属离子等的分离。
3. 弱阴离子交换填料：以胺基为主，通常用于无机阴离子、有机酸、磷酸等的分离。
4. 强阴离子交换填料：以季铵盐为主，常用于离子的选择性吸附分离、蛋白质去除等。
二、凝胶层析柱
1. 大孔凝胶层析填料：具有大的孔径和大的分子量，适用于大分子的分离和纯化，如蛋白质、糖类等。
2. 中孔凝胶层析填料：孔径和分子量较小，适用于中小分子的分离和纯化，如抗体、糖体、药物等。
3. 小孔凝胶层析填料：孔径和分子量非常小，适用于小分子有机物、酶、激素等的分离和纯化。
4. 离子交换凝胶层析填料：同时具有凝胶和离子交换功能，适用于对分子量和电荷具有选择性的物质的分离和纯化。
三、亲和层析柱
1. 金属亲和层析填料：以Ni、Co、Zn等为配位离子的柱子，适用于含有带金属结构的肽、蛋白质、核酸等的分离。
2. 免疫亲和层析填料：以特异性抗体为配体的柱子，可用于分离和纯化含有特定表位的蛋白质等物质。
3. 亲和层析填料：利用配位、化学键合、反相作用等与物质之间的亲和力实现分离和纯化。
以上是常见的层析柱填料种类及其特点，选择合适的填料可提高层析分离效率和纯化效果。
离子交换填料选择
离子交换填料的选择、处理和保存(1)离子交换填料的选择离子交换填料的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换填料。
首先是对离子交换填料电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换填料还是选择阴离子交换填料。
这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换填料；如带负电，则选择阴离子交换填料。
例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换填料进行分离。
强酸或强碱型离子交换填料适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。
由于弱酸型或弱碱型离子交换填料不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换填料。
其次是对离子交换填料基质的选择。
前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换填料等疏水性较强的离子交换填料一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换填料亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。
一般纤维素离子交换填料价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。
葡聚糖离子交换填料的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。
琼脂糖离子交换填料机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。
另外离子交换填料颗粒大小也会影响分离的效果。
离子交换填料颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示，目数越大表示直径越小。
前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。
另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换填料颗粒大小有关。
一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。
所以大颗粒的离子交换填料适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换填料适于需要高分辨率的分析或分离。
这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用，它们在生物大分子物质(蛋白质，酶，核酸等)的分离方面显示很大的优越性。
第五章 离子交换层析20130321
7
如果要分离纯化一种具有兼性离子特性的 生物大分子，其离子化的程度取决于它所在溶 液中的净电荷。生物分子带电荷与否，或带什 么样的电荷，主要决定于溶液的pH值。溶液的 pH值高于生物大分子的等电点时，就带负电荷， 解离成负离子；低于生物大分子的等电点时， 就带正电荷，解离成阳离子。因此，分离具有 兼性离子的生物大分子，要对溶液的pH值、生 物大分子的等电点和离子交换层析介质3种条 件同时进行考虑。 8
23
（四）介质粒度 介质粒度是指离子交换介质颗粒直径的大小， 单位是μm。常用的离子交换介质的粒度大小可 分为4类，即： 粗：颗粒直径在100—500μm左右，可用较 大规模制备。 中粗：颗粒直径在50～150μm左右，小型制 备兼分析。 中细：颗粒直径在20—80μm左右，用于分 析。 细：颗粒直径在5—30μm左右，微量分析， HPLC。 24
第五章
离子交换层析
孙晋民
第一节 概述 离子交换层析 （ion exchange chromatography）, 是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解 离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应 而进行分离的方法，这种层析方式称为离子交 换层析。 离子交换层析在无机化合物、有机化合物 和生物大分子的分离中应用最早、最广泛的方 法之一。它既可用于大规模工业化生产，也可 用于销量制备或研究分析。
阴 离 子
二乙基氨基乙基
氨基乙基
AE
-O-CH2-CH2-N+H3
12
（五）交换基团的交换反应式
阳离子交换基团: 磺酸基：一R—SO3-H+ + Na+
一R—SO3- Na+ + H+
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第四节 常用的离子交换层析介质及其特性
层析填料选择
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料 •特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化
10 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选 • Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。 Sepharose: Separation Pharmacia agrose
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料
21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架 • • • • 表面延伸剂
+
O
SO
3
配基:磺酸乙烷基
改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 颗粒大小：平均90um,75um,40um 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
层析填料选择
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料
•特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化 •基架：交联的烯丙基葡聚 糖与氮氮亚甲基丙烯酰胺 •颗粒大小：平均50um •动态载量：4mg/ml填料
20 / GE /
Source基架离子交换填料
－－高流速、低反压、高分辨率
化学材质：聚苯乙烯/二乙烯苯 颗粒均匀，硬度大，排阻极限可达107
50周年
－快速group separation首选 1959-2009
Sephadex 是由葡聚糖 交联环氧氯丙烷形成 的多孔结构
Sephadex: 羟基基团， 呈弱酸性
Sephadex : Separation Pharmacia Dextran
7/ GE /
Sephadex 系列填料
－快速group separation首选
15 / GE /
离子交换（IEX）－最受欢迎的层析方法
原理：根据生物分子的表面电荷性质进行分离纯化， 可以应用在层析的各个阶段。
重点：在于选择合适的分辨率。
16 / GE /
离子交换填料的分类
基本形式：
R（带电配基）
基架类型： – Sepharose 基架 – Source 基架 – Capto 基袈 – Sephadex基架 – 纤维素基架
• Sep。harose 6FF：分离范围10KD-4MD Sepharose 4FF：分离范围60KD-20MD 适用于巨大分子如多糖疫苗、病毒、乙肝表面抗原、 DNA质粒纯化。
12 / GE /
Superose系列填料
－分离范围最宽广的高分辨率凝胶过滤填料
•Superose 6分离范围：5k-5000K •Superose 12分离范围：1K-300K
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
层析柱填料的分类
层析柱填料的分类层析柱填料是一种常用的分离技术，在多个领域都有广泛的应用。
根据其物理性质和化学性质的不同，层析柱填料可以分为不同的分类。
本文将对层析柱填料的分类进行详细介绍。
一、根据物理性质分类1. 吸附填料：吸附填料是层析柱中最常用的一种填料。
其主要特点是表面具有较强的吸附能力，可以与待分离物质发生物理吸附作用。
常见的吸附填料有硅胶、活性炭、分子筛等。
吸附填料在生物制药、食品加工、环境监测等领域有广泛应用。
2. 离子交换填料：离子交换填料是一种带电的固体颗粒，其表面带有正或负电荷。
离子交换填料可以与待分离物质中的离子发生离子交换作用，实现分离纯化的目的。
常见的离子交换填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子交换填料在水处理、生物制药、化工等领域有广泛应用。
3. 柱色谱填料：柱色谱填料是一种高效分离的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的分离效果。
常见的柱色谱填料有C18、C8、氨基、硅胶等。
柱色谱填料在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。
二、根据化学性质分类1. 亲水性填料：亲水性填料是一种具有亲水性表面的填料，其主要特点是对亲水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的亲水性填料有硅胶、糖凝胶、羟基磷灰石等。
亲水性填料在生物制药、食品加工等领域有广泛应用。
2. 疏水性填料：疏水性填料是一种具有疏水性表面的填料，其主要特点是对疏水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的疏水性填料有疏水性聚合物、疏水性硅胶等。
疏水性填料在有机合成、食品加工等领域有广泛应用。
3. 离子互化填料：离子互化填料是一种可以与待分离物质发生离子交换作用的填料，其主要特点是对离子性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的离子互化填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子互化填料在环境监测、药物分析等领域有广泛应用。
三、根据粒径分类1. 大孔径填料：大孔径填料是一种具有较大孔径的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的传质效果。
离子交换层析柱和填料选择指南
1 参考文献: CRC化学与物理手册第83版，2002-2003年。
反离子 CCCCCCCCllllllll--------或或HHCCOOOO SCCOll--或42- CH3COO CCCCClllll-----
pKa (25 °C)1 4.75 5.33 6.04 6.48 6.65 9.10 7.76 8.07 8.52 8.52 8.88 8.88 9.50 9.73 10.55 11.12
表面净电荷
V
V
V
V
+
阳离子
0
pH
阴离子
–
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
2
图2. pH对选择性的影响（洗脱模式）。
V
4
样品制备
为了获得最佳的分离并避免层析柱性能的退化，正确 的样品制备是必要的。样本必须是澄清的，无颗粒物 质。 为了去除颗粒物质，过滤（过滤器孔径见缓冲液配制） 或离心（10000 g，15分钟）样品。脱盐样品使用 HiTrap™ Desalting 5 ml（体积达到1.5 ml）或HiPrep™ 26/10 Desalting（体积达到15 ml）转换为所选择的其 实缓冲液。在高盐浓度下不含主要污染的非常小体积 的样品可以用起始缓冲液稀释，以降低盐浓度到不干 扰填料的水平结合。
清洗程序，方案1
用4 CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗 脱pH稳定。 立即用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相 同）。
清洗程序，方案2
用2 CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有 0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1 M乙酸）。 用5 CV 70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同）， 直到紫外基线和洗脱pH稳定。 用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。
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离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析是一种常见的分离和纯化方法，广泛应用于生物、化学、环境等领域。
离子交换层析的基本原理是利用离子交换材料与待分离物质之间的化学亲和性差异，通过物质在离子交换材料中的分配来实现分离纯化。
离子交换层析的关键组成部分包括配基、基架和填料。
配基是指离子交换材料上的活性基团，其化学性质决定了材料的亲和性。
常见的配基包括阴离子交换基、阳离子交换基、强酸交换基和弱酸交换基等。
基架是指离子交换材料的骨架结构，常用的基架材料包括聚苯乙烯、聚乙烯、硅胶等。
填料是指用于填充离子交换柱的材料，常见的填料材料包括硅胶、聚合物、玻璃等。
离子交换层析的选择和优化要考虑到多个因素，如待分离物质的性质、离子交换材料的性能、离子交换柱的尺寸、流速等。
通过合理选择配基、基架和填料，并调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
总之，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，配基、基架和填料是其关键组成部分。
选择合适的离子交换材料和填料，并合理调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
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