生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验技术理论---层析理论
（5）凝胶过滤
原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下
移动的速度不同。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动 和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝 胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小 分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。
凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、
吸附层析示意图
吸附剂 易吸附分子
不易吸附分子
（4）亲和层析
原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的
层析技术。
专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗
原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体
载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。
如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、 聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。
聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。
示意图（交换树脂表面）
示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根）
可交换离子（钠离子）
交换离子
不交换离子
示意图
B物质
水分子
A物质
（3）吸附层析
原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一 个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时 间然后才离开，此为吸附现象。 吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形 成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团 之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。 在不同条件 下，占主要地维素、淀粉、聚 酰胺；滑石、陶土、粘土。
几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生 化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。
一、层析技术
1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理
生物化学实验@层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
层析技术公式
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
4.sephacryl (交联葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
层析技术及原理
实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
图3-1 A、B两组分的保留值 A保留值tR1’=tR1-tm B保留值tR2’=tR2-tm
二、层析峰区域宽度(Peak Width)
三.分离度(Rs)
指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍(图3-2)。
Rs tR 1 2
2
tR
1
(W 1 W 2 )
W1 W 2Rs Nhomakorabea tR W
若 Rs愈大，说明分离效果愈好。在实际分离过程中，各组分含量 不同，因而峰面积和峰宽在绝大多数情况下是不一致的，故一般用垂直 线法来计算。具体是连接两峰顶，再从两峰间的峰谷向基线作一垂线， f Rs g 此线和上述连线交于3处。从3到峰谷的距离为f，从3到基线距离为g (图 3-3)。
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
生物化学实验-层析实验
结果解释
实验结论
根据实验结果分析，得出实验的结论，如各组分的含量、比例以及 分离效果等。
结果解释
对实验结果进行合理解释，包括组分性质、分离原理等方面的解释。
误差分析
对实验结果进行误差分析，找出可能影响实验结果的因素，提高实 验的准确性和可靠性。
05
层析实验注意事项
安全注意事项
避免使用过期试剂
过期的试剂可能含有有害物质或产生 不稳定的结果，应避免使用。
要点二
检测程序
设置检测程序，控制检测器的参数，进行实时监测和记录 数据。
04
层析实验结果分析
数据记录
实验数据
在层析实验中，需要详细记录实 验过程中的各项数据，包括洗脱 液的体积、流速、检测波长等。
图像记录
层析实验通常伴随着色谱图的生 成，需要准确记录色谱图，包括 峰高、峰面积等关键信息。
异常情况记录
生物化学实验-层析实验
目录
• 层析实验简介 • 层析实验的种类 • 层析实验操作流程 • 层析实验结果分析 • 层析实验注意事项
01
层析实验简介
层析实验的定义
层析实验是一种分离和纯化混合物中 各组分的方法，利用不同物质在固定 相和流动相之间的分配差异进行分离。
它是一种常用的生物化学实验技术， 广泛应用于生物、医学、药学等领域。
使用高质量的试剂可以减少实验误差，提高 实验结果的准确性。
重复实验
对实验结果进行重复验证，以减少误差并提 高结果的可靠性。
标准化操作
按照标准化的操作步骤进行实验，避免因操 作不当导致误差。
数据处理
对实验数据进行正确的处理和分析，以减少 误差并得出准确的结论。
实验结果可靠性评估
层析工艺原理
层析工艺原理层析工艺原理层析工艺是一种常用的分离技术，通过溶液中成分的不同亲和性来实现分离。
它广泛应用于生物化学、制药、食品科学等领域中对复杂混合物的分离和纯化。
一、概述层析法是一种基于物质在固体或液体介质中分配系数差异而实现纯化和分离的方法。
它利用固定相（填充剂）和流动相（溶液）之间的相互作用来实现目标物质与杂质的有效分离。
二、基本原理1. 分配系数分配系数是指目标物质在两个非相溶溶剂之间的平衡浓度比值。
在层析过程中，目标物质与杂质会根据其在流动相和固定相之间的分配系数而被吸附或释放。
2. 固定相固定相是指填充剂，它可以是无机材料如硅胶、氧化铝，也可以是有机聚合物如聚丙烯酰胺凝胶。
填充剂表面通常具有一些特殊的功能基团，如离子交换基团、亲水基团等，这些基团可以与目标物质发生特异性相互作用。
3. 流动相流动相是指溶液，它可以是水、有机溶剂或其混合物。
流动相中通常会添加一些缓冲剂、盐类或其他添加剂以调节pH值、离子强度等参数，从而实现对目标物质的选择性吸附。
4. 层析模式层析模式包括亲和层析、离子交换层析、大小排除层析等多种类型。
不同的层析模式适用于不同的分离目标和样品类型。
例如，亲和层析适用于富含特定蛋白质的混合物分离；离子交换层析适用于分离带电荷的化合物；大小排除层析则适用于分离不同大小的分子。
三、操作步骤1. 实验前准备首先需要选择合适数量和类型的填充剂，并进行活化处理。
同时需要准备好流动相和样品，并将其过滤以去除杂质。
2. 样品加样将经过预处理的样品加入装有填充剂的色谱柱中，并使用流动相进行洗脱，以去除未结合的杂质。
3. 洗脱根据目标物质的亲和性和分配系数，选择适当的流动相进行洗脱。
在洗脱过程中，目标物质会与固定相表面发生特异性相互作用，并被吸附。
随着流动相的变化，目标物质会逐渐从固定相中解离出来。
4. 分析最终得到的纯化样品可以进行进一步的分析和鉴定。
常用的分析方法包括电泳、质谱、红外光谱等。
层析技术名词解释生物化学
层析技术名词解释生物化学层析技术是一种分离和纯化生物化学物质的重要方法，它基于物质在不同介质中的吸附、分配和扩散特性，通过调节介质的性质使得不同成分在介质中的分布系数不同，从而实现物质的分离和纯化。
本文将对层析技术中的一些重要名词进行解释，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
1. 层析柱层析柱是层析技术中的核心部件，它是一个管状容器，内部填充着特定介质。
物质在层析柱中的分离和纯化过程中，都是通过介质表面上的吸附、分配和扩散来实现的。
层析柱的大小、形状和介质种类都会影响到分离和纯化的效果。
2. 介质介质是层析柱中的填充物，它是层析技术中的重要因素之一。
介质种类的选择会对分离和纯化的效果产生直接的影响。
常见的介质有离子交换树脂、凝胶过滤介质、亲和层析介质等。
3. 扩散扩散是物质在介质中分离和纯化的重要过程之一，它是指物质分子在介质中的自由运动和相互碰撞的过程。
扩散速度受到介质孔径大小、温度和浓度等因素的影响。
4. 吸附吸附是介质表面吸附物质的过程，它是层析技术中的重要过程之一。
吸附速度受到介质表面特性、温度和浓度等因素的影响。
吸附过程中，物质会在介质表面形成静电相互作用，从而实现分离和纯化。
5. 分配分配是物质在不同相之间分配的过程，它是层析技术中的重要过程之一。
物质在介质中的分配系数受到介质表面性质、温度和浓度等因素的影响。
分配过程中，不同成分在介质中的分布系数不同，从而实现分离和纯化。
6. 洗脱洗脱是层析技术中的重要过程之一，它是指将物质从介质中洗出的过程。
洗脱液的选择和洗脱条件的调节都会对分离和纯化的效果产生影响。
常见的洗脱液有盐溶液、酸碱溶液和有机溶剂等。
7. 层析谱图层析谱图是层析技术中的重要分析手段，它是指将物质在层析柱中分离和纯化后所得到的峰形图谱。
层析谱图可以反映物质在介质中的分布和分离效果，从而辅助分析和定量。
8. 层析法层析法是一种分离和纯化生物化学物质的重要方法，它包括气相层析、液相层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
层析技术基本原理及应用
层析技术（Chromatography）是一种用于分离混合物中不同成分的重要方法，广泛应用于化学、生物化学、药学等领域。
以下是层析技术的基本原理及应用：
基本原理：
1. 分离原理：
-层析技术利用不同物质在固定相（stationary phase）和移动相（mobile phase）之间的分配系数不同来实现分离。
-样品在固相上受到吸附力和解吸力的影响，在移动相的推动下，不同组分以不同速度迁移，最终实现分离。
2. 类型：
-按照相对位置可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
-常见的层析技术包括气相色谱、液相色谱、离子色谱、薄层色谱等。
应用领域：
1. 生物化学：
-在蛋白质纯化、药物筛选、基因分析等方面广泛应用。
-用于分离和鉴定生物样品中的蛋白质、氨基酸、核酸等生物分子。
2. 制药工业：
-用于药物分析、药物提取和纯化等环节。
-常用于药物配方中主成分和杂质的分离和检测。
3. 环境监测：
-用于水质、大气、土壤等环境样品中有害物质的检测与分析。
-能够帮助监测环境中的污染物并进行有效处理。
4. 食品安全：
-在食品中添加剂、残留农药、重金属等的检测和分析中发挥作用。
-有助于确保食品安全和合规。
总的来说，层析技术通过精密的分离原理和操作流程，可以对复杂混合物进行高效分离和分析，为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
生物化学中的层析技术
生物化学中的层析技术生物化学是研究生物体内化学成分和化学变化的科学领域。
层析技术是生物化学中常用的一种分离和纯化方法，通过利用物质在不同相之间的分配行为进行分离。
本文将介绍生物化学中的层析技术及其在科研和实验中的应用。
一、什么是层析技术层析技术是一种基于物质在不同相或载体中的分配行为进行分离的方法。
它利用分配系数不同的物质在固相和液相之间的分配行为，通过不同的分离条件实现目标物质的纯化或分离。
层析技术广泛应用于生物化学、有机化学和分析化学等领域。
二、层析技术的分类1. 按固相类型分类（1）柱层析：将固相填充在柱子中，通过液相的流动将目标物质与杂质分离。
常见的柱层析包括凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
（2）薄层层析：将固相涂覆在玻璃或塑料板上，通过液相的上升和扩散分离物质。
薄层层析广泛应用于分离、纯化和鉴定有机化合物等。
2. 按液相类型分类（1）液液层析：液相为液体，通过两种不同性质的液体在固相上的分配行为分离物质。
液液层析包括正相层析和反相层析等。
（2）气液层析：液相为溶解在惰性气体中的液体，通过物质在气液界面的分配行为分离物质。
气液层析常用于鉴定挥发性有机化合物。
三、层析技术的应用1. 生物样品的纯化层析技术在生物化学中被广泛应用于样品的纯化和分离。
例如，蛋白质的纯化通常使用离子交换层析、分子筛层析或亲和层析等方法。
这些层析技术具有高分离效率和纯度，可以快速且有效地纯化目标蛋白质。
2. 生物大分子的分离层析技术也用于生物大分子（如核酸和多肽）的分离和纯化。
例如，核酸的分离常使用凝胶过滤层析和亲和层析等方法；多肽的分离则可以使用反相层析和凝胶过滤层析等方法。
3. 药物分析与检测层析技术在药物分析和检测中起着重要作用。
例如，高效液相层析（HPLC）可以用于药物代谢产物的分离和定量分析，以及药物纯化和质量控制等方面的应用。
4. 工业生产中的应用层析技术在工业生产中也有广泛的应用。
例如，酒精的分离可以使用蒸馏和分子筛层析等方法；有机酸的分离和纯化则可以使用阴离子交换层析等方法。
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层析技术一、层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。
二、常用的层析技术有亲和层析、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、分配层析五种。
层析方法分类表三、柱层析的设备与操作：柱层析是指将固定相装填于柱中进行层析的方法。
优点被分离物质可多可少，既可用于定性定量分析也可用于物质的制备。
1、柱层析的设备柱层析的基本设备有层析柱，恒流装臵(恒流泵，它可以产生均一的流速，并且流速是可调的)和接收装臵。
( l ）层析柱层析柱一般为玻璃管制成，其下端为细口，出口处带有玻璃烧结板或尼龙网。
柱的直径和长度之比是1：10~40层析柱的内壁直径大于1cm ，以防产生“管壁效应”，即由于流动分子在柱中心移动慢，沿管壁移动快，而使区带成为凸形的现象。
当层析的目的是要把小分子物质分离开，则层析柱体积应是样品体积的4 一10 倍。
高度与直径比是5 : 1 一15:1 。
当层析的目的是要分离大分子物质时，则层析柱的体积应为样品体积的25 —100 倍，高度直径比为一100 : 1 。
）( 2 ）恒流装臵在层析过程中，必须保证流动相流过固定相。
因此试剂的加人必须有恒流装臵加以控制。
最简单的恒流装臵是恒压瓶（Mariotte 瓶）。
这实际上是一下口瓶，其塞上插人一根玻璃管。
它通过密封的层析柱和环境之间大气压的平衡来控制洗脱液的流速。
当洗脱液流出瓶子后，在剩下的溶液顶部就产生部分真空，管A 内溶液的水平面就下降，当下降到管的末端，空气就进人容器，出现气泡。
管A 最下端压力等于大气压。
静水压是从 B 点算起，与瓶中溶液深度无关。
这个压力恒定的，因此洗脱液的流出速度是恒定的。
恒压瓶装臵简单，但洗脱液流出速度不好整制。
另一种恒流装臵是恒流泵，它可以产生均一的流速，并且流速是可调的。
( 3）接受装臵洗脱液的接收可以手工用试管一管一管地接。
不过最好使用部分收集器，这种仪器带有上百支试管，可准确定时换管、自动化程度很高。
( 4 ）其他较高级的装臵可配臵检测器并连接记录仪。
四、柱层析的操作（以DE-52离子交换层析剂分离SOD为例）（1）装柱将洗净的层析柱垂直固定，柱内先装入洗脱液，让溶液迅速从柱中流出，以赶走气泡，可用手轻弹柱底部的接管。
接着在洗脱液流不断情况下夹住出口，在瓷芯上一块中400目的圆形尼龙网。
开始加入搅拌均匀的纤维素浆液，打开出口，调节流速为0 . 3ml/min 让纤维素随溶液下流缓慢均匀地沉降。
此间不断补充纤维素浆液，待纤维素浆液加入完毕，在基质表面加入一层滤纸，大小要合适。
关闭出口，让纤维素下沉5 -10分钟。
接下来打开出口，使柱中多余的洗脱液流出柱床（切勿低于柱床面）。
这一步要适当提高出水口接管（待柱床形成后逐渐增加静水压）。
接着接入洗脱液平衡柱子。
好柱的标准是装填均匀、松紧一致、没有气泡和裂缝、基质表面平整。
( 2）上样经过平衡的层析柱，当平衡液面到与固定相表面一致位臵时，关闭柱下端出口，用滴管或移液管环绕柱壁轻轻地把被分离样品的溶液加到固定相表面。
加样时要避免冲动基质，加入样品液的体积一般应小于床体积的1 / 2 。
打开柱下端出口，待样品液面流到固定相表面时，将出口关闭。
用滴管加入洗脱液高出柱面2cm，打开出口，柱上端与装有洗脱液的恒压瓶或恒流泵连接，开始洗脱。
调节流速1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集。
( 3 ）洗脱和收集将样品上样并等交换平衡以后，则可进行洗脱。
离子交换层析需用梯度洗脱，即随着洗脱的进行，洗脱液的离子强度或pH值在逐渐变化着。
其原理是，随着离子强度的增强，洗脱液中的离子对电荷基团上的电荷的竞争力也随之增强，原来与电蔺基团结合的物质离子，则被按结合力由弱到强的顺序洗脱下来。
而pH梯度的变化，则引起物质解离状态的变化，从而使它与电荷基团结合力减弱而被洗脱下来。
梯度洗脱时，梯度的形成需要使用梯度混合器。
梯度混合器是由两个彼此相通的圆筒容器加上搅拌装臵组成。
洗脱的方法有两种，即改变离子强度和改变PH 值。
改变离子强度时，洗脱液为稀缓冲液中溶入简单盐（如KCI 或NaCI ) ，洗脱时其离子梯度是增加的。
这时A 容器中为低浓度盐溶液，B 容器中为高浓度盐溶液。
改变pH值的梯度溶液是两个不同PH 值而组分相同的溶液。
若是pH值从低到高递增（使用阳离子交换剂时），则低pH溶液在A 容器中，高pH值溶液在B 容器中。
若是pH值由高到低（使用阴离子交换剂）则正好相反。
也可用无梯度的洗脱液进行洗脱。
要控制适当的洗脱速率，太快和太慢都会降低分辨率。
分部收集洗脱开始时，柱下端出口要与部分收集器接通。
按每管1.5ml连续收集。
在洗脱过程中要将收集的每管溶液进行浓度或活性测定，根据结果绘出洗脱曲线。
洗脱曲线以管号或洗脱体积为横坐标，每管的浓度或活性为纵坐标。
为了获得满意的分离效果，洗脱液流速不仅要恒定，而且其大小要控制恰当。
如果太快，洗脱物在两相中平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。
(5）基质的再生用过的基质，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程称为再生。
五、层析的常用术语1、固定相固定相是由层析基质组成的，它包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液）。
这些物质能与有关化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
2、流动相指在层析过程中推动被分离物质向一定方向移动的液体或气体。
在柱层析时，流动相又称为洗脱剂，即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液。
在薄层层析时，流动相又称为展开剂。
3 、操作容量：操作容量指在一定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。
操作容量一般以每克或每毫升基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数。
其数值越大，表明基质对某种成分的亲和力越强。
4 、床体积床体积指基质在层析柱中所占有的体积（Vt ）。
Vt 是基质的外水体积和内水体积（vi ）以及自身体积（vg）的总和，即Vt = vo + Vi ＋Vg5 、外水体积（Vo ）指基质颗粒间空间的体积。
6 、内水体积（vi ）指基质颗粒内部空间的体积。
7、基质体积（Vg）指基质自身所具有的体积。
Vo 、Vi 、Vg 都随着床体积和基质性质变化而变化。
8、洗脱体积（Ve ）指某一成分从柱顶部洗脱开始到在底部洗脱液中出现浓度最大值时所用的洗脱液的体积。
9、膨胀度（Wβ）在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积，即每克干物质所具有的床体积。
10、凝胶用量的计算。
据凝胶的膨胀度和层析柱半径(r)、所需高度（h），按下式可计算干凝胶用量六、离子交换层析原理、类型及离子交换剂的制备用离子交换树脂作支持物，分离离子状态化合物的一种方法。
基本原理是静电引力。
这种层析法以离子交换剂为固定相，以具有一定pH值和离子强度的电解质溶液为流动相。
已广泛应用于许多生化物质（如氨基酸、核昔酸、多肤、蛋白质、糖类等）的分析、制备、纯化等。
（一）基本原理离子交换剂是由载体、电荷基团、平衡离子（反离子）构成的。
载体都是化学惰性、不溶性的物质。
电荷基团是离子交换剂的功能基团，它以共价键与载体相结合，电荷基团带正电荷，则称这种交换剂为阴离子交换剂；如电荷基团带负电，则称这种交换剂为阳离子交换剂。
交换剂的电荷基团以静电引力结合着与其电荷相反的离子，称为平衡离子。
离子交换剂对各种离子和离子化合物亲和力不同，所以可以把不同离子物质分开。
其分离过程如下：首先将样品进入交换剂，使其充分接触，使样品中与平衡离子有相同电荷的离子与平衡离子发生交换，样品中的离子与电荷基团以静电引力结合。
然后将不带电荷分子和平衡离子从介质中洗掉。
接着是用洗脱液将与交换剂结合的离子洗脱。
由于交换剂与不同离子亲和力不同，所以洗脱时，先把与交换剂结合弱的离子洗下来，最后才能把结合强的离子洗下来，从而使不同离子得以分离。
对于呈两性离子的蛋白质、多肽、核苷酸等物质，其亲和力主要决定于它们的理化性质和一定pH条件下呈现的离子状态。
当pH低于等电点时，它们呈正电荷；当pH高于等电点时它们带负电荷。
pH值离等电点越远，它们与交换剂结合力越强。
（二）离子交换剂根据离子交换剂的结构，离子交换剂可分为树脂型和多糖型。
前者称离子交换树脂，后者无统一的名称。
离子交换树脂因这类离子交换剂的载体是一种人工合成的、与水亲和力较小的树脂物质而得名。
常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯聚合成的聚苯乙烯型树脂。
二乙烯苯是交联剂，它能把聚乙烯苯直链化合物以交叉的方式连接成立体网状的结构，网孔在20~50目之间；整体呈球状。
再将不同的电荷基团引入到苯环上，则形成不同类型的离子交换树脂。
离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
多糖类离子交换剂这类离子交换剂的载体是一类天然或人工合成的、与水有较大亲和力的多糖及其衍生物。
常用的有纤维素和葡聚糖。
纤维素离子交换剂是以微晶纤维素为载体引人电荷基团构成的。
根据引入基团所带的电荷，也可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。
每一类交换剂又可分为强、中强和弱三种类型。
较常用的有引入磷酸基团的磷酸纤维素（P --纤维素、强酸型），引人二乙基胺乙基的二乙基胺乙基纤维素（DEAE 一纤维素、弱碱型），引人竣甲基（一CH2 一COOH）的羧甲基纤维素（cM 一纤维素、弱酸型）。
（三）性质1 ．交联度离子交换剂的载体是通过交联剂交联而制成的固体物质。
每种载体中于含的交联剂的百分数即交联度是不同的。
树脂的交联度范围为2 ％一16 ％。
树脂交联度的大小与其对离子进行交换的选择性有关。
2．膨胀度膨胀度是指每克干离子交换剂在水溶液中吸水的毫升数。
不同的载体膨胀度不同。
多糖类离子交换剂膨胀度可达6ml／g （2009年实测DEAE－52）干物质，而离子交换树脂最高可达100ml/g 干物质。
交联度越大，膨胀度越小。
膨胀度还与电荷基团、溶液的离子强度和pH值有关。
3 ．交换容量交换容量是指离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物进行交换的能力。
一般用总交换容量和有效交换容量表示。
交换容量受多种因素的影响：( l ）筛孔有效交换容量与离子交换剂的筛孔直径以及分离物分子量大小密切相关。
当分离物一定时，筛孔越大，交换容量越大。
( 2 ）离子强度当溶液中离子强度增大时，离子对电荷基团的竞争作用增加，从而降低了交换剂有效的交换容量。
这也是增加洗脱液离子强度，能洗脱与电荷基团结合较强的离子的道理所在。
( 3 ) PH 值当溶液pH值改变时，交换剂上电荷基团的解离状态要发生变化，从而使之交换容量发生变化。
例如，弱阴离子交换剂的交换容量随着pH值的下降而增大。
（四）离子交换层析的操作1、离子交换剂的选择选择理想的交换剂是提高分辨率和有效成分获得率的重要前提：选择交换剂时应从如下几方面加以考虑。