角膜缘干细胞体外培养的研究进展
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２０ ０７正
右 江 民族 医 学 院学 报
第 ６期
室上性 心动过速 的对 比研 究［］兰 州大学学 报 ，０ ５ ３ Ｊ． ２ ０ ，１
（ ）２ ． ３ ：０
查的临床意义 ［］ 山东医学 ，０ ３４ （ ） １ ． Ｊ． ２ ０ ，３ ４ ：５ 食 ３例 ［０ 朱霞 ． 管心 房调搏 治疗 老年人 室上 性心 动过 速 ３ ２］ ［］ 浙江医学 ，０ ２２ （ ）４ ３ １ ． Ｊ． ２ ０ ，４ ７ ：１ —４ ４ 杨蔚 南 ． 连续减频 法经 食 管心房 调搏 复律 阵发 ［１ 洪俊旦 ， ２］ 性室上性心动过速的探讨［ ］中国心脏起搏与心电生理 Ｊ．
杂志 ，０ ３ １ （ ）２ ２ ２ ０ ，７ ４ ：７ ． ［２ 翟永新 ． ２］ 阵发性室上性心动过 速三种终 止发作 方法的疗 效 比较 ［］岭南心血病杂志 ，０ ４ １ （ ） ３４ Ｊ． ２ ０ ，０ ５ ：５ ． 宋书峰 ， 李春 生 ， 王明 空 ， 经 食 管调搏 与 药物转 复 阵 等． ［３ ２］ 发性室上速的疗效对 比［］实用医学杂志 ，０ ６ ２ （ ） Ｊ． ２０ ，３ ８ ：
１ （０ ：４ ． ４１）８９ 刘松 ， 辛辉 ． 射频 消融术前 行经食 管 房 调搏 检 ７ ｔ ［９ 郑方胜 ， １］
李 食管 心房 调搏 超速 抑制 终止 Ｐ Ｖ Ｓ Ｔ疗 ［４ 时建华 ， 公义 ． ２］ 效观察 ［］ 山东 医药 ，０ ４４ （８ ：９ Ｊ． ２ ０ ，４ ２ ） ３ ．
文章编号 ：１０ —５ １ （０ ７０ —０ ９ —０ ０ １ ８ ７ ２ ０ ）６ ９ ７ ３ ２ ２ 角膜缘干细胞 的分离和培养 常用 的分 离方法有 组织块 ． 直 接培养 、 消化法及两种方法同时应用 的混合法。 ２ ２ １ 组织块培养法 将上述组织块剪成 １ ｌｌ ｒｍ×ｌ ．． ｎｌ ×１ Ｔ ａ ｍｍ 大小 ， 放入含少量纯胎 牛血清培 养瓶 中密闭 ２ ， 慢加 入少量 ｈ缓 培养 基 ，７ ， ％０３ ，５ ３℃ ５ ２９ ％湿度孵化箱过 夜 ， 日补加培 养基。 次 接 种后 ３天 首 次换 液 ， 以后隔 日换 液 ， 日倒置 显 微镜 观 察。 每 此法操 作环节少 ， 细胞 损伤小 ， 减少 污染 机会 。但 培养 时 间 可 长， 细胞成分复杂 ， 常混有纤维 细胞 ， 分离和纯化较困难。 ２ ２ ２ 酶消化法 将组织块剪成 ２ ｍ ×２ ｍ 大小 ， ｎ ．． ｎ１ ｎ１ Ｈａｋ液 冲 洗 ２次 ， ．５ ／ １２ ｇ Ｌ胰 蛋 白酶 与 ０ ２ ／ Ｄ Ａ １ １混合 为 消化 ．ｇＬＥ Ｔ ： 液 ， 量 为 组 织 量 的 ３ －５ 用 ０ ０倍 ， 消化 １ － １ｍｉ 组 织 块 疏 松 ， ０ ５ ｎ到 弃去 消化液 。Ｈ ｎ ａｋ液冲洗 ２次 ， 除 Ｅ Ｔ 消 Ｄ Ａ消化作 用 ， 加入等 量 ２０ ／ ０ ｍｌＬ胎牛血 清 的细胞培养 液终 止胰 蛋 白酶消 化。吸 出 培养液后再 加入新的培养液 ２次 ， 消除残余 消化作用 。然后加 入 培养液进 行吹打使 细胞分散 ，００ ／ 离心 ５ ｎ 取重 悬细胞 １０ ｒ ， ｍｉ， 以 １０×１ Ｌ接种量移入有孔培 养板进行 培养 。此法 可在较 ０ ０／ 短时 间内获 得细胞进 行培养 和研究 ， 操作 复杂 ， 消化 时 间 但 对 和 温度的控 制有较高的要求。 ２ ２ ３ 混合法 即上述两种方法 同时使用 。组织块消 化后所 ．． 得 的细胞悬液 移人培养器进行 培养的 同时 ， 组织块也 一起移 将 人同时培养 。此 法培养 的细胞 易存 活 ， 形成 膜 片时 间短 ， 获得 的细胞 中含有 少量纤 维细胞 ， 能增加 上皮 膜 片的张 力强 度 ， 既 又能起到“ 饲细胞 ” 的作用 ， 促进 细胞生 长 ， 有利 于细胞 成膜 生 长进行移植研究 。 ． ３ 培 养 基 的 选 择 角膜缘干细胞 在 体外培 养时 具有极 高 的增殖 潜力 。由于 各人采用 的培养基不同 ， 增殖力亦有 所不 同。 目前用于 角膜缘 干细胞 的基础 培养液 主要有 Ｉ Ｍ、 ＭＥ Ｆ１（ ： ）Ｍ１９ ） ＭＥ Ｉ Ｍ／ ２ １ １ 、 ９ 、 ） Ｍ１９ Ｆ ２ １１ 、 Ｒ 一１４ ９ ／ １ （ ：） Ｐ ＭＩ ６ ０等 。目前 大多采用 Ｄ Ｍ／ １ ＭＥ Ｆ ２ （：） １ １及添加激素的上皮细胞 培养液 （ Ｈ Ｍ） 基本 培养基 ， ＳＥ 做 加 入 １ ％小 牛血清 ，．ｍｇ ｍｌ ０ ０ ３ ／ 谷氨酸胺 ，、 ｕ ｎ 胰岛素 ， ．ｐ ／ ０ Ｉ／ ｉ ｌ ０ ５． ｇ ｍｌ 氢化 可的松 ，０ ｇｍｌ 皮生 长 因子 ， ． ８ １ｎ ／ 表 ０ １ｍｍｏＡ 腺 嘌 呤 ， ｌ ０ １ ／ ．ｍｇ １霍乱毒素 等。但 何种培 养基 最适 于培养 角膜 缘 干细
收稿 日期 ：０ ７ ５ １ ２ ０ —０ —２
角 膜缘 干 细胞 体 外培 养 的研 究进 展
朱 良勇 。 自力 贺 （ 西 柳州 市工人 医院 ， 西 医科大 学 第 四附属 医院 ， 西 柳 州 ５ ５ ０ ） 广 广 广 ４ ０ ５
关键词 ：角膜 缘； 干细胞 ； 外培养 ； 体 眼损伤 中图分类号 ：Ｒ ２ ．９ ３ ９ ４ 文献标识码 ：Ａ
９ １ ４ ．
马 韩伟 华 ， ． 等 食管 电 生理对 室 上性心 动 ［５ 姚锦容 ， 家蔚 ， １］ 过速类型 的诊断意义 ［］广东 医学 ，０ ４ ２ （０ ：１ ７ Ｊ． ２ ０ ，５ １ ） １９ ． 吴武萍 ， 炜华 ． 郭 食管 心房 调搏 与心 内 电生理 对诊 断快 ［６ １］ 速心律失常 的对照研究 ［］ 山西 医药杂 志 ，０ ６ ３ （ ） Ｊ． ２ ０ ，５ ３ ：
２ ８． ３
改 ２导联心 电 图结合食 管 心 电图在 室上性 心 ［７ 彭旭 ． 良 １ １］ 动过速诊断 中的作用 ［］ 临床 心电学杂 志 ，０ ６ １ （ ） Ｊ． ２ ０ ，５ １ ：
３ ． ３
张 冯义 柏 ， ． 等 阵发性 室上 性心 动过 速 的 ［８ 李裕舒 ， 家 明， １］ 急诊分类诊断方法 的时机 ［］ 中华急诊 医学杂志 ，０ ５ Ｊ． ２０ ，
２０ ０７正
右 江 民族 医 学 院学 报
第 ６期
室上性 心动过速 的对 比研 究［］兰 州大学学 报 ，０ ５ ３ Ｊ． ２ ０ ，１
（ ）２ ． ３ ：０
查的临床意义 ［］ 山东医学 ，０ ３４ （ ） １ ． Ｊ． ２ ０ ，３ ４ ：５ 食 ３例 ［０ 朱霞 ． 管心 房调搏 治疗 老年人 室上 性心 动过 速 ３ ２］ ［］ 浙江医学 ，０ ２２ （ ）４ ３ １ ． Ｊ． ２ ０ ，４ ７ ：１ —４ ４ 杨蔚 南 ． 连续减频 法经 食 管心房 调搏 复律 阵发 ［１ 洪俊旦 ， ２］ 性室上性心动过速的探讨［ ］中国心脏起搏与心电生理 Ｊ．
杂志 ，０ ３ １ （ ）２ ２ ２ ０ ，７ ４ ：７ ． ［２ 翟永新 ． ２］ 阵发性室上性心动过 速三种终 止发作 方法的疗 效 比较 ［］岭南心血病杂志 ，０ ４ １ （ ） ３４ Ｊ． ２ ０ ，０ ５ ：５ ． 宋书峰 ， 李春 生 ， 王明 空 ， 经 食 管调搏 与 药物转 复 阵 等． ［３ ２］ 发性室上速的疗效对 比［］实用医学杂志 ，０ ６ ２ （ ） Ｊ． ２０ ，３ ８ ：
１ （０ ：４ ． ４１）８９ 刘松 ， 辛辉 ． 射频 消融术前 行经食 管 房 调搏 检 ７ ｔ ［９ 郑方胜 ， １］
李 食管 心房 调搏 超速 抑制 终止 Ｐ Ｖ Ｓ Ｔ疗 ［４ 时建华 ， 公义 ． ２］ 效观察 ［］ 山东 医药 ，０ ４４ （８ ：９ Ｊ． ２ ０ ，４ ２ ） ３ ．
文章编号 ：１０ —５ １ （０ ７０ —０ ９ —０ ０ １ ８ ７ ２ ０ ）６ ９ ７ ３ ２ ２ 角膜缘干细胞 的分离和培养 常用 的分 离方法有 组织块 ． 直 接培养 、 消化法及两种方法同时应用 的混合法。 ２ ２ １ 组织块培养法 将上述组织块剪成 １ ｌｌ ｒｍ×ｌ ．． ｎｌ ×１ Ｔ ａ ｍｍ 大小 ， 放入含少量纯胎 牛血清培 养瓶 中密闭 ２ ， 慢加 入少量 ｈ缓 培养 基 ，７ ， ％０３ ，５ ３℃ ５ ２９ ％湿度孵化箱过 夜 ， 日补加培 养基。 次 接 种后 ３天 首 次换 液 ， 以后隔 日换 液 ， 日倒置 显 微镜 观 察。 每 此法操 作环节少 ， 细胞 损伤小 ， 减少 污染 机会 。但 培养 时 间 可 长， 细胞成分复杂 ， 常混有纤维 细胞 ， 分离和纯化较困难。 ２ ２ ２ 酶消化法 将组织块剪成 ２ ｍ ×２ ｍ 大小 ， ｎ ．． ｎ１ ｎ１ Ｈａｋ液 冲 洗 ２次 ， ．５ ／ １２ ｇ Ｌ胰 蛋 白酶 与 ０ ２ ／ Ｄ Ａ １ １混合 为 消化 ．ｇＬＥ Ｔ ： 液 ， 量 为 组 织 量 的 ３ －５ 用 ０ ０倍 ， 消化 １ － １ｍｉ 组 织 块 疏 松 ， ０ ５ ｎ到 弃去 消化液 。Ｈ ｎ ａｋ液冲洗 ２次 ， 除 Ｅ Ｔ 消 Ｄ Ａ消化作 用 ， 加入等 量 ２０ ／ ０ ｍｌＬ胎牛血 清 的细胞培养 液终 止胰 蛋 白酶消 化。吸 出 培养液后再 加入新的培养液 ２次 ， 消除残余 消化作用 。然后加 入 培养液进 行吹打使 细胞分散 ，００ ／ 离心 ５ ｎ 取重 悬细胞 １０ ｒ ， ｍｉ， 以 １０×１ Ｌ接种量移入有孔培 养板进行 培养 。此法 可在较 ０ ０／ 短时 间内获 得细胞进 行培养 和研究 ， 操作 复杂 ， 消化 时 间 但 对 和 温度的控 制有较高的要求。 ２ ２ ３ 混合法 即上述两种方法 同时使用 。组织块消 化后所 ．． 得 的细胞悬液 移人培养器进行 培养的 同时 ， 组织块也 一起移 将 人同时培养 。此 法培养 的细胞 易存 活 ， 形成 膜 片时 间短 ， 获得 的细胞 中含有 少量纤 维细胞 ， 能增加 上皮 膜 片的张 力强 度 ， 既 又能起到“ 饲细胞 ” 的作用 ， 促进 细胞生 长 ， 有利 于细胞 成膜 生 长进行移植研究 。 ． ３ 培 养 基 的 选 择 角膜缘干细胞 在 体外培 养时 具有极 高 的增殖 潜力 。由于 各人采用 的培养基不同 ， 增殖力亦有 所不 同。 目前用于 角膜缘 干细胞 的基础 培养液 主要有 Ｉ Ｍ、 ＭＥ Ｆ１（ ： ）Ｍ１９ ） ＭＥ Ｉ Ｍ／ ２ １ １ 、 ９ 、 ） Ｍ１９ Ｆ ２ １１ 、 Ｒ 一１４ ９ ／ １ （ ：） Ｐ ＭＩ ６ ０等 。目前 大多采用 Ｄ Ｍ／ １ ＭＥ Ｆ ２ （：） １ １及添加激素的上皮细胞 培养液 （ Ｈ Ｍ） 基本 培养基 ， ＳＥ 做 加 入 １ ％小 牛血清 ，．ｍｇ ｍｌ ０ ０ ３ ／ 谷氨酸胺 ，、 ｕ ｎ 胰岛素 ， ．ｐ ／ ０ Ｉ／ ｉ ｌ ０ ５． ｇ ｍｌ 氢化 可的松 ，０ ｇｍｌ 皮生 长 因子 ， ． ８ １ｎ ／ 表 ０ １ｍｍｏＡ 腺 嘌 呤 ， ｌ ０ １ ／ ．ｍｇ １霍乱毒素 等。但 何种培 养基 最适 于培养 角膜 缘 干细
收稿 日期 ：０ ７ ５ １ ２ ０ —０ —２
角 膜缘 干 细胞 体 外培 养 的研 究进 展
朱 良勇 。 自力 贺 （ 西 柳州 市工人 医院 ， 西 医科大 学 第 四附属 医院 ， 西 柳 州 ５ ５ ０ ） 广 广 广 ４ ０ ５
关键词 ：角膜 缘； 干细胞 ； 外培养 ； 体 眼损伤 中图分类号 ：Ｒ ２ ．９ ３ ９ ４ 文献标识码 ：Ａ
９ １ ４ ．
马 韩伟 华 ， ． 等 食管 电 生理对 室 上性心 动 ［５ 姚锦容 ， 家蔚 ， １］ 过速类型 的诊断意义 ［］广东 医学 ，０ ４ ２ （０ ：１ ７ Ｊ． ２ ０ ，５ １ ） １９ ． 吴武萍 ， 炜华 ． 郭 食管 心房 调搏 与心 内 电生理 对诊 断快 ［６ １］ 速心律失常 的对照研究 ［］ 山西 医药杂 志 ，０ ６ ３ （ ） Ｊ． ２ ０ ，５ ３ ：
２ ８． ３
改 ２导联心 电 图结合食 管 心 电图在 室上性 心 ［７ 彭旭 ． 良 １ １］ 动过速诊断 中的作用 ［］ 临床 心电学杂 志 ，０ ６ １ （ ） Ｊ． ２ ０ ，５ １ ：
３ ． ３
张 冯义 柏 ， ． 等 阵发性 室上 性心 动过 速 的 ［８ 李裕舒 ， 家 明， １］ 急诊分类诊断方法 的时机 ［］ 中华急诊 医学杂志 ，０ ５ Ｊ． ２０ ，