细胞核和线粒体的分离实验报告
实验二 细胞器的分离与提纯
实验二细胞器的分离与观察一、教学目的与要求1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。
2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。
二、实验原理线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。
在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
三、实验用品器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。
材料：新鲜的猪肝脏。
试剂：见PAGE 64四、实验步骤1. 制备猪肝细胞匀浆。
实验前购买新鲜猪肝脏备用。
割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。
实验一、线粒体的分离与观察
3、器材
高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼 龙织物、玻璃匀浆器。
四、实验方法
1．制备大鼠肝细胞匀浆
实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速 用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称25 mol／L缓冲蔗糖溶液 洗涤数次。然后在0～4℃条件下，按每克肝加9ml冷的 0.25mol／L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液 应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意 尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离 过程不宜过长，以保持组分生理活性。
(2）线粒体：
取线粒体沉淀涂片（注意勿太浓密），不待干即 滴加1％詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。 线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验注意事项
应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其 生理活性。
六、作业
将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否 混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。 根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在 高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能 够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部， 从而分批收集。
• 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶 体——内质网与高基体——核蛋白体。
Differential centrifugation
三、实验用品
1、材料
大鼠肝脏
2、试剂
①生理盐水。
②1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
③0.25 mol／L蔗糖十0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）：
④0.34 mol／L蔗糖十0.01 mol/L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)一、实验目的1.熟悉细胞分离和鉴定的基本操作方法。
2.掌握用离心技术从小鼠肝脏中提取细胞核的方法。
3.通过细胞核染色体形态的观察，了解细胞核在生物体中的作用。
二、实验原理细胞分离和鉴定是细胞学的基础实验，也是细胞学研究的重要手段之一。
细胞分离是将组织或细胞块中相关性高的细胞或不同类型的细胞分离开，以便进行对其性质和功能的分析和研究。
细胞鉴定是针对某种细胞类型，利用某种特异性分辨手段，对该细胞的特定结构或成分进行检测和区分，以便识别该细胞类型的性质和角色。
2.离心技术离心是利用离心机中高速旋转的离心头，通过离心力的作用，使样品中不同的物质沉淀到零件上，从而实现分离的技术手段。
离心用于分离固体及液体的混合物，也可用于分离生物学样品中的细胞、细胞器、酶和其他生物大分子，常用于提取细胞核或线粒体等细胞器。
三、实验步骤1.制备小鼠肝脏组织样品取2只小鼠，用无菌注射器注射适量无菌生理盐水溶液，待小鼠麻醉后，将小鼠放在消毒过的工作台上，采用外科手术的方法，将小鼠的腹部切开，取出小鼠肝脏，用无菌生理盐水清洗小鼠肝脏，用吸水纸吸干水分后，将小鼠肝脏组织分为小块状，存放于无菌离心管中备用。
2.分离细胞核将小鼠肝脏样品加入预冷的离心管中，用等体积的细胞破碎缓冲液A混合，使溶液刚好能淹没样品。
再次加入等体积的细胞破碎缓冲液B，使样品浓度适当。
将混和物在冰上慢慢摇晃，5分钟后，离心5分钟，去除上清液，洗涤后继续离心5分钟，去除上清液，洗涤后再次离心5分钟，去除上清液，离心操作后小鼠肝脏组织在管底沉淀下来。
3.制备细胞核标本将离心完成后的小鼠肝脏组织中的细胞核有效部分，制备成固定标本。
首先，将组织标本样品用福尔马林固定10-20分钟；然后，在干净玻璃片上滴上碘静（10-15μL），用酒精进行漂白，再用氢氧化钠溶液中和酒精，将玻璃片在空气中晾干，制备成细胞核标本。
4.细胞核染色滴一滴核染色剂（主要成份为酸性染料FOSCIN）在经过固定、漂白、中和后的细胞核标本中央，静置2-3分钟，漂洗干净后，在细胞核标本切片下滴上甘油凝胶，覆盖上玻片，并晾干即可。
实验六细胞器的分离与观察总结
(1)匀浆(Homogenization)低温条件下，
将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质
(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之
成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速 离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离， 使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的 转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉 淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离 心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级 分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗 粒，需经反复悬浮和离心加以纯化。
(3)分析 分级分离得到的组分，可用细胞化
学和生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
1899年Pappenheim 首创了甲基绿-哌洛宁 （mehtyl-green-pyronim）染色法。1902年 Unna对这一方法进行了改良。1940年Brachet 研究证明用甲基绿—哌洛宁对DNA和RNA有选 择性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于 碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而 使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA 被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色， 这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来 。
线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。
实验九--细胞组分的分级分离
3.将剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸 入盛有冰块的器皿中，研磨3～5次，用8层湿纱布 过滤匀浆于离心管中。然后制备一张涂片①，做 好标记，自然干燥。
有什么不同？涂片③在你的实验结果中 纯度如何？ 3.描述一下涂片⑤所见结果。
谢 谢大家
以上有不当之处，请大家给与批评指正， 谢谢大家！
14
• 6.将①、②、③涂片用1％甲苯胺兰染色后盖上盖 片即可观察。
高速离心分离提取线粒体步骤：
1.•将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取 出，配平后，以17000r/min离心20分钟，弃上清，留取沉 淀物。
2.加入0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L•氯化钙液 1ml•， 用吸管吹打 成悬液， 以17000r/min离心20分钟。将上清吸入另一试管。 留取沉淀物，加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙 溶液混匀成悬液。
• 4.将装有滤液的离心管配平后，放入离心机， 2500r/min离心15分钟；⑴取上清液，移入高速离 心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体 用;⑵同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥； ⑶余下的沉淀物进行以下步骤。
• 5.用6ml 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液， 悬浮沉淀物，以2500r/min离心15分钟弃上清，将 残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载 玻片上，涂片③，自然干燥。
3.取沉淀物上清液和悬液，分别滴一滴于干净的载玻片上（分 别标记为④、⑤），涂片，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液， 盖上盖片染20分钟。
线粒体实验报告
线粒体实验报告线粒体实验报告引言：线粒体是细胞内的一个重要器官，其主要功能是产生能量。
在本次实验中，我们将探索线粒体的结构和功能，并通过实验验证线粒体在细胞中的作用。
一、线粒体的结构线粒体是一种双层膜结构的细胞器，其外层膜和内层膜之间形成了线粒体间隙。
线粒体内部含有线粒体基质，基质中含有线粒体DNA、线粒体核糖体等。
线粒体内膜上有许多呈褶皱状的结构，称为线粒体内膜嵴。
线粒体内膜嵴增加了内膜的表面积，有利于线粒体的功能发挥。
二、线粒体的功能线粒体的主要功能是进行细胞呼吸和产生能量。
细胞呼吸是指将有机物质氧化分解为二氧化碳和水，并释放出大量的能量。
线粒体中的线粒体基质通过线粒体内膜嵴上的各种酶参与细胞呼吸过程，产生三磷酸腺苷（ATP）等能量物质。
ATP是细胞内的主要能量供应物质，为细胞的正常运作提供动力。
三、线粒体的重要性线粒体在细胞中起着至关重要的作用。
首先，线粒体是能量的主要来源，维持细胞的正常代谢活动。
其次，线粒体还参与细胞的信号传导、细胞凋亡等过程，对细胞的生长和发育具有重要影响。
最后，线粒体还参与细胞的抗氧化防御，减轻氧化应激对细胞的损害。
四、线粒体实验设计与结果为了验证线粒体的功能和重要性，我们进行了一系列实验。
首先，我们通过显微镜观察了细胞中的线粒体结构。
实验结果显示，线粒体呈椭圆形或长条形，分布在细胞的不同区域。
接下来，我们使用荧光染料标记线粒体，并观察其在细胞中的运动。
实验结果显示，线粒体在细胞内不断移动和融合，维持细胞的能量平衡。
最后，我们通过抑制线粒体功能的药物处理细胞，观察细胞的生长和代谢活动是否受到影响。
实验结果显示，抑制线粒体功能后，细胞生长明显受阻，代谢活动减弱。
五、线粒体与疾病线粒体功能异常与多种疾病的发生发展密切相关。
线粒体疾病是一类常见的遗传性疾病，包括线粒体脑肌病、线粒体肌无力症等。
这些疾病主要由于线粒体DNA突变或线粒体功能异常引起，严重影响患者的生活质量和寿命。
实验五 线粒体的分离与观察讲义资料
涂片过程：
五、实验结果
光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或 哑铃状。
五、实验报告
实验目的 实验用品 实验原理 实验方法 思考题
六、思考题
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行 ？
2.绘制玉米黄化苗的线粒体装片的观察结果,根据你 的实验结果,分析所分离的线粒体的纯度如何?
实验五 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异， 因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同 。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分 离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀 浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进 行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级 分离和分析三步，这种方法已成为研究亚 细胞成分的化学组成、理化特性及其功能 的主要手段。
线粒体干物质的主要成分是蛋白质。蛋白质在室温和高 温环境下都难以长期保存。低温环境能有效保持蛋白质 的稳定性，包括结构和功能。温度过高，线粒体里的蛋 白可能变性而丧失活性等。温度过低，虽然能有效保存 蛋白质，但是低温导致膜结构脆性增大，提取过程中的 物理机械剪切力可能使线粒体破损。完整得提取线粒体 要注意对线粒体的各个结构的保护。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速（
r/min）
细胞实验教案1.
细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。
二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
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细胞生物学实验报告
1
实验五 细胞核和线粒体的分离
一、实验目的
1、了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。
2、熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验原理
1、分离纯化的方法
为了研究某种细胞器的结构、功能或制备某种生物大分子，常需要大量采集
细胞的某些亚组分，因此，有必要分离细胞器。
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行
分离、浓缩和提纯的一种方法。主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。
差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。
被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
密度梯度离心：预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种
颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同梯度层内。
匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖溶液（0.25mol/L）。它比较接近细胞质
的分散相，具有足够的渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在
pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、细胞器的鉴定
细胞核——姬姆萨染液 线粒体——詹纳斯绿 B
詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细
胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还
原，成为无色状态。
三、实验用品
1、试剂:生理盐水、 0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液
(pH7.4)、0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、1%詹纳斯绿B
染液、姬姆萨染液
2、材料: 兔子肝脏
3、器材：解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器
4、设备：高速离心机
四、实验步骤
1、制备兔肝细胞匀浆：向兔血管注射空气针处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水
洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓
冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓
细胞生物学实验报告
2
冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤
备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，
以保持组分生理活性。
2、差速离心：先将3ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地
加入3ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机按图顺序进行差速离
心。
分离细胞核
兔肝匀浆
↓
过滤
↓
滤液（涂片一张）①（各种细胞器）
↓
滤液3ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
700×g离心10min
↓
沉淀 （细胞核及碎片） 上清液 →作涂片②（线粒体及碎片）
↓加0.25mol/L预冷蔗糖液至5ml ↓10000 g离心10 min，弃上清液
混合液 沉淀（线粒体）
↓1000g 离心10 min，弃上清液 ↓加预冷0.25mol/L蔗糖液，吹匀
沉淀 混合液
↓加0.3—0.5ml蔗糖液，混匀 ↓10000 g离心10 min
作涂片③（细胞核）
沉淀（线粒体） 上清液（较轻物质）
↓ ↓
作涂片④ 作涂片⑤
五、内容讨论
1、密度梯度离心法的优缺点？
优点：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；
②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一
定浮力密度差的颗粒；
③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，防止已形成的区带由于对流而引起混合。
缺点：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
2、为什么选择肝细胞？
肝脏细胞合成比较旺盛，能量代谢也比较旺盛。所以细胞核比较好提取，线粒体
也多一些。
细胞生物学实验报告
3
3、差速离心法的优缺点？
优点:操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大
的角式转子。
缺点:①分离效果差，不能一次得到纯颗粒;须经反复悬浮和离心加以纯化;
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀;
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
4、注意事项
注意尽可能先充分剪碎肝组织,缩短匀浆时间,整个分离过程不宜过长,以保持组
分生理活性。最好在在0~4℃或冰浴中进行
将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入,同时及时离心,以防匀浆液中
的颗粒自然下沉过快,影响后面的离心分层效果
姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制,效果较好。过期的应用液不可使用。
六、思考作业
推测各张片子的染色结果，并写明你做出判断的原因。
①：用Giemsa染色为粉红色，少部分紫红色，形状有球形和颗粒状等，推测为
细胞匀浆，因为观测到许多深浅不一的染色物。
②：用Giemsa染色为粉红色，存在多种形状，无深紫色，推测为无细胞核的匀
浆，因为经低速离心后，细胞核应在沉淀中被分离开。
③：用Giemsa染色为紫红色，大量球形细胞器，推测为细胞核，因为在次低速
离心使细胞核纯度增加。
④：用健那绿—B染色为蓝绿色的散在粒状和短棒状的颗粒，推测为线粒体，因
为在高速离心下使较重的线粒体沉淀。
⑤：用健那绿—B染色为接近无色，推测为细胞质和一些较轻的物质，因为线粒
体被分离，而细胞质被还原为无色。