大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养
大鼠胰岛微血管内皮细胞分离、纯化与培养的改进
大鼠胰岛微血管内皮细胞分离、纯化与培养的改进孙嘉;张桦;蔡德鸿【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2008(024)007【摘要】目的:建立稳定可靠的大鼠胰岛微血管内皮细胞分离培养方法.方法:分离纯化大鼠胰岛后进行内皮细胞选择性培养,使用UEA-1包被的免疫磁珠对胰岛微血管内皮细胞进行纯化.免疫荧光法检测经典的内皮细胞标志物第Ⅷ因子相关抗原(vWF)和cD34的表达和吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)能力.结果:胰岛培养4-5 d后,可见内皮细胞从贴壁的胰岛内爬出,通过UEA-1包被的免疫磁珠筛选出胰岛微血管内皮细胞接种后24 h细胞开始贴壁.该细胞具有单层生长、接触抑制的特性.大鼠胰岛微血管内皮细胞表达vWF和CD34,可摄取Dil-Ac-LDL.结论:本研究方法是一种较为高效的分离、纯化和培养大鼠胰岛微血管内皮细胞的方法.【总页数】3页(P1454-1456)【作者】孙嘉;张桦;蔡德鸿【作者单位】南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282;南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282;南方医科大学附属珠江医院内分泌科,广东,广州,510282【正文语种】中文【中图分类】R335+.6【相关文献】1.大鼠胰岛分离纯化方法的改进 [J], 杨永生;孙宝震;解英俊;赵吉生;王春艳;张学文;李巍2.原代大鼠胰岛细胞分离纯化及单细胞培养初探 [J], 罗瑞琼;韦芳;荣曦;刘红3.大鼠胰岛分离纯化技术的改进 [J], 李永翔;李戈;董维平;陈静;卢大儒;谭建明4.大鼠肺微血管内皮细胞的体外分离培养与纯化 [J], 梁宏伟;冯波;朱雯宇;王建舫;张涛;穆祥5.大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定 [J], 袁宇;丛聪;张静;魏玲玲;李胜富;金熙;麦刚;李幼平;程惊秋;陆燕蓉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展
生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。
其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。
近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。
近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。
本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。
图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。
国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。
2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。
酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。
1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。
组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。
大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立
大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立【摘要】目的应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(Retinal Microvascular Endothelial Cells， RMECs)血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。
方法体外培养RMECs，在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系。
结果经分离培养的RMECs在 Matrigel上培养形成管腔样结构。
结论 RMECs能够在Matrigel上形成血管腔。
【关键词】视网膜微血管内皮细胞;细胞培养;血管形成Abstract: Objective To induce Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells (RMECs) to Form New Blood Vessels by setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. It would be a basic experimental study for the retinal-related disease. Methods By culturing RMECs in vitro and setting up a stable angiogenesis culture system on Matrigel. Results RMECs were lumina formation on Matrigel. Conclusions RMECs can be induced to form mew blood vessels on Matrigel in vitro.Key words: Retinal Microvascular，Endothelial Cells; cell culture; angiogenesis血管内皮细胞密切参与糖尿病微血管病变和肿瘤血管新生等病理过程[1，2]。
原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定
原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定马华根;唐元瑜;纪立金【摘要】目的:建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法.方法:取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO2培养箱中进行原代培养.通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞.结果:在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的“铺路石样”涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99％以上.结论:该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞.%Objective:To establish a method that can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.Methods:The microvascular segments of the rat brain were obtained from 7 to 10 d SD rats by homogenation,bovine serum albumin gradient centrifugation and digestion with collagenase type Ⅱ and then they were cultured in carbon dioxide incubator.The cultured cells were identified by cell morphology observation and immunohistochemical detection of Ⅷ factor-related antigen.Results:Under the inverted microscope,the cells in vitro cultured for 24 h to 48 h,emerged from the microvascular section of the wall.The cells were fusiform-shaped or polygonal-shaped,and proliferated in a clustered monolayer.The typical "paving pebbles" sample was observed after the cells became dense.The correlation antigen of Ⅷ factor was positive,the cytoplasm was brown,and the positive cells accounted formore than 99％.Conclusion:The method can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2018(041)003【总页数】4页(P276-279)【关键词】脑;微血管内皮细胞;原代培养;Ⅷ因子相关抗原;大鼠【作者】马华根;唐元瑜;纪立金【作者单位】福建中医药大学中医学院,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122【正文语种】中文脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是构成血脑屏障的主要成分之一,它能通过选择性双向跨细胞膜转运系统及细胞间的紧密连接将脑组织与体循环分隔开,限制蛋白质和大多数极性分子进入脑组织,只有少部分蛋白质和多肽能以转胞吞方式通过血脑屏障进入血液[1];并且BMECs在脑的物质代谢、纤溶与止血、免疫应答等方面也发挥着重要作用,与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散,尤其是脑肿瘤的血管生成等病理过程密切相关[2-3]。
大鼠肺微血管内皮细胞使用说明
大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。
细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。
肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。
本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩(第三军医大学新桥医院, 重庆 630037)摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。
将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。
血细胞立即从肺组织周围游出。
继而是肺微血管内皮细胞。
成纤维细胞及其他细胞72h才游出。
培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。
后者可通过传代除去。
获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。
关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养 肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。
目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。
故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。
虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。
分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。
国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。
本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。
1 材料和方法1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。
新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。
兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。
荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。
荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。
抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。
L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。
胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。
大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。
1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。
小鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养
切、 蛋 白酶 消化 、 过滤方法 ， 并进 行 了相 关鉴 定 ， 可 获得 较 纯 的 小 鼠 心 肌微 血 管 内 皮 细胞 ， 这 为研 究 心 肌 微 血 管 内皮 细 胞
的迁移 、 血 管再 生 等提 供 了实 验 来 源 。 【 关 键 词】 心 肌 ； 微 血 管 内皮 细胞 ；培 养
４ ～ ６周 的 清 洁级 Ｃ ５ ７小 鼠 的 心 室 肌 ， 利用胰蛋 白
酶 及 Ⅱ型 胶 原 酶 消化 过 滤 收 集 的 滤 液 进 行 重 新 悬 浮 种 植 于 明胶 包被 的 培 养 瓶 中 ， 通 过 倒 置 电 镜 观 察 细 胞 的 生 长 形 态 及 生长状 态， 得 出生 长 曲 线 ， 并 利 用免 疫 荧 光 鉴 定 （ ・ Ａ肌 微 血 管 内皮 细 胞 特 异 性 抗 原 ｖ Ｃ ＷＦ ） 培 养 出的小鼠・ Ａ肌 微 血 管 内皮 Ｃ 细 胞 。 结 果 通 过 形 态 学观 察 及 免 疫 荧 光 鉴 定 证 实为 小 鼠 心 肌 微 血 管 内皮 细胞 。 培 养 的 小 鼠 心 肌 微 血 管 内皮 细胞 第 ｌ 、 ２天 生 长 相 对 缓 慢 ， 而到 第 ３ 、 ４天 细 胞 呈 对数 生 长 ， 第６ 、 ７天 细胞 达 到 融 合 。 结 论 采 用 明胶 包被 培 养 瓶 ， 通 过 机 械 剪
西部 医学 ２ ０ １ ３年 ３月 第 ２ ５卷 第 ３期 Ｍｅ ｄ Ｊ Ｗｅ ｓ ｔ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ， Ｍａ ｒ ｃ ｈ ２ ０ １ ３ ， Ｖｏ １ ． ２ ５ ， Ｎｏ ． ３
・ ３４ ３ ・
Байду номын сангаас
小 鼠心 肌微 血 管 内皮 细胞 的体 外培 养 ＊
陈桂 秀 ， 杨 明涛 ， 刘 涛 ， 王 浩宇 ， 刘 康。 ， 冯 刚。
黄芪多糖对大鼠心肌膜微血管内皮细胞免疫相关分子表达的影响
在为 阐 明 ＡＰ Ｓ的免 疫增 强机 制提供 资料 。
ｌ 材 料 与 方 法
１ ． １ 主要试 剂 及仪 器
ＡＰ Ｓ （ 南 京泽 朗 医药科 技 有
１ ． ４ Ｅ Ｉ Ｉ Ｓ Ａ 细胞 的分组 与处 理 试 验使 用第 ３代
细胞 ， 将 生 长 至 汇 合 状 态 的细 胞 用 ０ ． ２ ５ Ａ 胰 蛋白 ０ 酶 消化脱 壁 ， 调 整细胞密度为 １ ． ０ ×１ ０ ／ ｍＩ ， 接 种 于９ ６ 孔 培 养板 ， 细胞 培养 至 ８ ０ 汇合 状态 时 ， 更 换 为含 ２ Ｆ Ｂ Ｓ的维持 培养 基 ， ＡＰ Ｓ有 效 成 分 按 终 浓 度 分别 为 ５ ０／ ， ｇ ／ ｍＩ 、 ｌ ５ ０／ ￣ ｇ ／ ｍＩ 、 ４ ５ ０／ ￣ ｇ ／ ｍＩ 加入 ， 每孑 Ｌ ５“ Ｉ ， 分 别 于孵育 ６ ｈ 、 １ ２ ｈ 、 ２ ４ ｈ 、 ４ ８ ｈ后 收 集
细胞 上 清液 ， 冻存 于 一８ Ｏ 。 Ｃ 备用 。
１ ． ５ ＲＭ ＭＶＥＣｓ表 面 ＶＣＡＭ一 １ 、 Ｍ ＨＣ一 Ⅱ表 达 的
检测
采用 免疫组 化 染 色 方 法 ， 按 试 剂盒 说 明 进行
鼠（ 购 自中国科学 院遗 传 与发 育 生 物 学研 究 所 ） ， 无
菌 摘取 心脏 ， 剪下 左 心 室 壁 ， 撕 去 心外 膜 和心 内膜 ，
近年 来 ， 微 血 管 内皮 细 胞 （ ＭＶＥ Ｃ ｓ ） 越 来 越 受 到 关 注， 它不仅 在炎 症 和免 疫 应 答 方 面具 有 十 分 重要 的
作用 ， 而且 作 为 一种 抗 原 呈 递 细胞 ， 可 向 Ｔ 细 胞 呈 递抗 原 ｌ 】 ］ ， 激 活 后 还 可 以 表 达 或 上 调 表 达 多 种 免 疫
白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡的研究
检测Ｃ ＭＥ Ｃ的凋亡； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 法检 测 细胞 蛋 白 激 酶 Ｂ （ Ａ ｋ ｔ ） 、 磷酸化 Ａ ｋ ｔ 、 缺 氧诱 导因子 １ ｄ （ ＨＩ Ｆ １ ａ ） 蛋 白表 达 或磷酸化 水平。结果 与 缺 氧 复 氧 １组 比 较 ， 不 同 浓度 白藜 芦 醇 １组 均 可 增 加 Ｃ ＭＥ Ｃ增殖能力 ， 呈剂量依赖性 ， 以
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ ｙ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｒ ｅ ｓ ｖ ｅ ｒ ａ ｔ ｒ ｏ ｌ ｏ ｎ ｈ ｙ ｐ ｏ ｘ ｉ ａ ／ ｒ ｅ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ （ Ｈ／ Ｒ） 一 ｉ ｎ —
Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ａ ｈ ｙ ｐ ｏ ｘ ｉ ａ ／ ｒ ｅ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ｉ ｎ ｊ ｕ ｒ ｙ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ｗａ ｓ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｂ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ＣＭＥＣ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ．Ｔｈ ｅ ＣＭ ＥＣ ｗｅ ｒ ｅ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｍｌ ｙ ｄ ｉ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ １ ， Ｈ／ Ｒ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ １ ， ａ ｎ ｄ Ｈ／ Ｒ＋ ｒ ｅ ｓ ｖ ｅ ｒ ａ ｔ ｒ ｏ ｌ （ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ５， １ ０， ２ ０ ， ３ ０ ｏ ｒ ４ ０￣ ｍｏ ｌ ／ Ｌ）ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ １ ． Ｐｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ＣＭＥＣ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ
大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养
大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养
陈小菊
【期刊名称】《川北医学院学报》
【年(卷),期】2008(023)005
【摘要】目的探讨一种分离和培养大鼠肺微血管内皮细胞(LMVEC)的简单方法. 方法组织贴块法培养大鼠LMVEC,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性,并采用免疫组化方法进行鉴定.结果获得的LMVEC具有规律的铺路石镶嵌状排列,内皮细胞特异性抗体CD31免疫组化染色阳性. 结论组织贴块法培养LMVEC是简单可行的.
【总页数】3页(P458-460)
【作者】陈小菊
【作者单位】川北医学院附属医院呼吸内科,四川,南充,63700
【正文语种】中文
【中图分类】R322.3+5
【相关文献】
1.肺循环灌注对大鼠肺微血管内皮细胞分离和培养的影响 [J], 肖贞良;孙耕耘;钱桂生
2.小鼠肺微血管内皮细胞磁珠分选法分离和原代培养 [J], 孙振朕;蔡在龙;朱科明;邓小明
3.大鼠肺微血管内皮细胞的体外分离培养与纯化 [J], 梁宏伟;冯波;朱雯宇;王建舫;张涛;穆祥
4.不同酶消化液对大鼠肺微血管内皮细胞分离培养的影响 [J], 李佩珊; 张志欢; 孙雄; 吴显平; 张永红; 张涛
5.大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展 [J], 白祥慧;邹登朗;祁得胜;刘忠浩;马建滨;都玉蓉
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·论著·大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养
唐标 曹苏 康焕菊 朱翔 陈秋萍 盛俞【摘要】 目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞离体培养方法。方法 选取1～2周龄的SD大鼠,无菌条件下快速取出心脏,彻底去除大血管、心房、右心室和心内外膜。用植块法培养心肌微血管内皮细胞。倒置显微镜下形态学观察结合免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原和CD34对培养细胞进行鉴定。结果 细胞呈单层贴壁生长,融合后呈“铺路石样”;第Ⅷ因子相关抗原和CD34免疫细胞化学鉴定阳性。结论 成功培养出纯度较高的大鼠心肌微血管内皮细胞,方法简便,可用于心血管疾病的研究。【关键词】 微血管内皮细胞;心肌【中图分类号】 R541 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-3685(2010)08-0941-02
Cultureofratmyocardialmicrovascularendothelialcellsinvitro TANGBiao,CAOSu,KANGHuanju,etal.DepatmentofAnesthesiology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,CHINA
【Abstract】 Objective Toestablishamethodofculturingratmyocardialmicrovascularendothelialcells(MMVECs)invetro.Methods SDrats(1-2weeksofage)wereselected.Theheartwasrapidlyexcisedandthegreatvessels,atria,rightventricle,epicardiumandendocardiumwereremoved.Explantscultivationofcardiactissueswasusedtoobtaintheprimarycells.ThepurifiedcellswereidentifiedasvascularendothelialcellsbymorphologyandpositiveimmunocytochemistryforfactorⅧ-relatedantigenandCD34.Results Thecellswereadherent,proliferatedinamonolayer.Cobblestonelikecellswereobservedundermicroscopeaftercoalesced.ThecellsshowedpositivestainingforfactorⅧ-relatedantigenandCD34.Conclution MMVECswithhighpurityareobtained.Themethodissimpleandconvenient,andcanbeusedtostudythecardiovasculardisease.【Keywords】 Microvascularendothelialcells;Myocardium[JiangsuMedJ,April2010,36(8):941-942.]
作者单位:226001 南通大学附属医院麻醉科责任作者:曹苏 E-mail:mzkcs@sina.com
心肌缺血性损伤是临床常见的病理现象,心肌微血管内皮细胞(MMVECs)的功能和病理改变直接影响心肌细胞的功能。MMVECs与大血管内皮细胞之间及各脏器微血管内皮细胞之间表现出不同的功能异质性。MMVECs是心肌缺血损伤的起始部位[1,2],对心肌缺血及再灌注损伤等研究有重要
价值。
材料与方法一、实验材料CO2培养箱(ESPEC,日本);超净台(苏州净化设备有限公司);高糖DMEM和0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);内皮细胞生长添加剂、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体和兔抗鼠CD34多克隆抗体(北
京迈晨科技有限公司);即用型免疫组化试剂盒和浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。二、实验方法1.取材 选取1～2周SD大鼠(南通大学实验动物中心提供),用碘伏浸泡消毒,无菌条件下开胸,快速取出心脏。在高糖DMEM基础培养基中洗净血液,用眼科剪剪去大血管、心房和右心室,剪开左心室。用75%乙醇浸泡10s以灭活心内膜和心外膜细胞,在基础培养基中洗净乙醇。在解剖显微镜下,用显微镊和显微剪刀完整剥去心外膜,剪去心内膜。余下的心肌用基础培养基洗两遍。2.原代培养和传代 把心肌剪碎成约1～2mm3组织块,将组织块快速接种于事先用含胎牛血清培养基润湿过的一次性培养皿中。组织块间距约2～3mm。置于37℃,5%CO2培养箱中孵育2h。等组织块贴牢后加入高糖DMEM完全培养基(含
·941·江苏医药2010年4月第36卷第8期 JiangsuMedJ,April2010,Vol36,No.820%的胎牛血清、50mg/L肝素、15mg/L内皮细胞生长添加剂、100U/L青霉素、100mg/L链霉素)。置于CO2培养箱37℃培养65h,去除组织块,更换培养基,继续培养3～4d。等细胞生长接近融合时传代培养,倒弃原培养基,用基础培养基洗涤两遍。加入0.15%胰蛋白酶1ml,常温下消化约3min,镜下见细胞收缩、细胞间隙增宽,接着细胞变圆变亮成簇时倾去消化液,加入完全培养基。用滴管轻轻吹打,制成细胞悬液。余未脱落细胞可能为成纤维细胞,弃去。将细胞悬液按1∶2接种于新的培养皿。因血管内皮细胞传代后易失去组织特异性,我们将二代以内的细胞用于实验。3.免疫细胞化学鉴定 将细胞悬液接种至放有盖玻片(已用多聚赖氨酸包被)的24孔培养板内。细胞生长至约80%融合时倒去培养基,用0.01MPBS洗涤两遍。室温下,用4%多聚甲醛固定5min,0.3%TritonX-100破膜5min。37℃下10%正常山羊血清封闭30min,用ABC法检测Ⅷ因子相关抗原和CD34的表达。兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体和CD34多克隆抗体浓度均为1∶50,4℃孵育过夜。室温下,二抗孵育2h。用DAB(1∶50)显色。结果一、MMVECs的生长与形态组织块在37℃CO2培养箱中孵育24h,可见组织块边缘有少量梭形细胞长出。原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞铺满时呈“铺路石样”(见封三页图1)。二、免疫细胞化学染色用免疫细胞化学ABC法检测Ⅷ因子相关抗原和CD34,胞浆中有棕黄色着色,即呈阳性反应(见封三页图2、图3)。95%细胞以上呈阳性。讨论培养心肌微血管内皮细胞(MMVECs)较为困难。我们根据张涛等,Nishida等[3,4]的方法,结合本实验室的条件,成功地实现了这种MMVECs的分离培养。我们的方法具有以下优点:(1)用基础培养基替代PBS和hanks液等洗涤心脏和组织块,能提供更充足的养分,最大程度地保护心肌组织,利于细胞长出,提高成功率。(2)75%乙醇灭活结合心内外膜剥除。剪开左心室后先用75%乙醇浸泡10秒,使心内外膜充分地与乙醇接触,达到灭活心内外膜细胞的目的。然后在解剖显微镜下用镊子完整剥下心外膜,用显微剪刀充分剪除心内膜。最大程度地避免成纤维细胞等的污染。解决了细胞纯度的关键问题。(3)接种组织块的培养皿先用含血清培养基润湿底壁,在干枯培养阶段,能充分供应各种养分,减少组织损伤,使组织块贴壁更牢固。在植块65小时时即把组织块去除,避免随后的成纤维细胞及其它细胞的爬出。在传代时用差速消化法进一步去除成纤维细胞[3]。我们选用出生1～
2周的SD大鼠,组织细胞分裂增殖能力较强。大量研究证明MMVECs在心脏生理与病理过程(如缺血、心肌肥大等)中发挥着非常重要的作用。血管内皮细胞通过合成与释放多种生物活性物质调节血管张力、血细胞黏附性,影响组织的代谢[5]。在
心肌缺血性损伤中,MMVECs是受累的起始部位和心肌损伤的起因。内皮细胞功能紊乱,白细胞黏附、渗出、浸润至心肌组织是心肌缺血-再灌注损伤的重要病理机制。熟练、成功地体外分离和培养MMVECs对于研究心脏的病理生理具有重要价值。
参考文献[1] AirdWC.Endothelialcellheterogeneity[J].CritCareMed,2003,31(4Suppl):221-230.[2] 娄晋宁.微血管内皮细胞培养及其在医学研究中的应用[J].微循环学杂志,2004,14(3):5-8.[3] 张涛,滕可导,田启超,等.乳鼠心肌膜微血管内皮细胞的体外培养[J].解剖学报,2008,39(2):121-123.[4] NishidaM,CrakeyWW,GerrotsenME,etal.Isolationandcharacteristicsofhumanandratcardiacmicrovascularendothelialcells[J].AmJPhysiol,1993,264(2Pt2):639-652.[5] NieL,WiseML,PetersonDM,etal.Avenanthramide,apolyphenolfromoats,inhibitsvascularsmoothmusclecellproliferationandenhancesnitricoxideproduction[J].Ather-osclerosis,2006,186(2):260-266.(收稿日期:2010-01-05)(供稿编辑:王建华)
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