猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT_PCR检测方法的建立
猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴别诊断方法的建立
中,兽医科学 2020,50(12): 1515-1521Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-10-20 D O I：10.16656/j.issn.l673-4696.2020.0211中图分类号：S852.659.6 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2020) 12-1515-07猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴别诊断方法的建立史喜菊，刘全国，李炎鑫，赖平安，刘艳华，徐立伟，马贵平(中国海关科学技术研究中心，北京100026)摘要：为了准确鉴别猪流感病毒(S1V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒（P R R S V)的感染，本研究建立了可同时检测和鉴别SIV、N A-P R R S V和E U-P R R S V的一步法多重荧光R T-P C R方法，并进行了临床应用。
研究结果表明，所建立的多重荧光R T-P C R最低检测限可达1〜10copies/n L，特异性为100%。
SIV、N A-P R R S V和 E U-P R R S V单荧光R T-P C R与多重荧光R T-P C R相比，相关性系数硭值大于0.999，所有扩增效率£值均 在9 0%〜10 0%之间，扩增性能良好，多重混合对特异性和敏感性未产生明显干扰。
对病毒核酸样品的验证100%符合，从89份N A-P R R S V阳性样品中检测出N A-P R R S V阳性88份（88/89)，从28份S1V阳性样品中检测出S I V阳性28份（28/28)，从这两类阳性样品中检测出S I V和N A-P R R S V双阳性4份（4/117);从82 份N A-P R R S V阴性样品中检测到E U-P R R S V和S I V阳性各1份；从105份未知感染状态的临床样品中筛查出2份S I V阳性和3份N A-P R R S V阳性。
本研究建立的多重荧光R T-P C R方法实现了 一次检测同时鉴别多种病毒的目的，适用于猜流感和诸繁殖与呼吸综合征混合感染的快速筛查。
一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立
一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立王建华;董志珍;王玉玲;肖妍;赵祥平【摘要】为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒(NiV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA),线性范围分别为4.6×101～4.6×107和4.1×101～4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0％,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)发生交叉反应.用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性.本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)002【总页数】8页(P348-355)【关键词】尼帕病毒;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒;TaqMan-MGB探针;二重荧光RT-PCR方法【作者】王建华;董志珍;王玉玲;肖妍;赵祥平【作者单位】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300456;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300456;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300456;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300456;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300456【正文语种】中文【中图分类】Q78尼帕病毒(Nipah virus，NiV)是20世纪90年代末在马来西亚确定的一种严重危害人和猪的新病毒，引起人和猪以神经系统和呼吸系统疾病为特征的NiV感染[1]。
猪繁殖与呼吸综合征的临床症状及治疗措施 - 养猪技术
猪繁殖与呼吸综合征的临床症状及治疗措施-养猪技术猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的一种急性、高度传染性疫病，呈地方流行性。
猪繁殖与呼吸综合征病毒只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。
患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。
下面我们就一起来看看猪繁殖与呼吸综合征的临床症状及治疗措施。
1、临床症状急性型。
①母猪：是主要的受害猪群。
表现为精神不振、厌食、发热（40~41℃）、咳嗽，并有程度不同的呼吸困难。
部分母猪双耳、腹部及其外阴部皮肤出现一过性青紫色血斑，所以有人称该病为蓝耳病。
还有部分母猪出现肢体麻痹性神经症状。
妊娠后期发生早产、流产（流产率可达50%~70%）、死胎（可达35%）、木乃伊胎（可达25%）和产出弱仔猪。
流产胎儿多发生在妊娠后期，而后出现重复发情、受胎率低（受胎率可降低5%）。
②仔猪：以1月龄内的仔猪最易感，感染后症状明显。
早产的仔猪，在出生后当时或几天内死亡。
大多数初生仔猪表现为体温升高达40℃以上，精神不振，呼吸困难，眼睑水肿，肌肉震颤，共济失调，后肢麻痹，打喷嚏，嗜睡。
有的仔猪耳尖、耳边、四肢末端和腹侧皮肤发绀，死亡率高达80%~100%，而耐过的仔猪生长缓慢，易继发其他疾病。
③生长猪和肥育猪：对该病的易感性较低，感染后仅表现轻度的临床症状。
④种公猪：发病率较低，一般为2%~5%。
公猪感染后，主要表现为一般性临床症状，但公猪精液品质下降、精子活力降低，配种受胎率下降，精液可带毒，4周后才能逐渐恢复。
慢性型。
此为该病的主要形式。
主要表现为猪群的免疫功能下降，易继发感染其他细菌性和病毒性疾病；猪群的生产性能降低，生长缓慢；母猪群的繁殖性能下降。
猪群的呼吸道疾病（如传染性胸膜肺炎、附红细胞体病、支原体肺炎链球菌病等）发病率明显上升。
亚临床型。
PRRSV,PCV2和SS2多重PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告
PRRSV,PCV2和SS2多重PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告1. 研究背景和意义猪繁殖障碍与免疫缺陷综合征 (porcine reproductive and respiratory syndrome and immune deficiency syndrome, PRRS)是猪场中常见的一种疾病，由猪繁殖障碍病毒 (PRRSV) 引起。
此外，猪圆环病毒 (PCV2) 也是猪场中常见的病毒，可以导致多种疾病，如猪圆环病、沙眼性皮肤病和肾脏病等。
还有一种病毒叫做猪链球菌 (SS2) 可能会导致猪场中的疾病，在猪圈中引起大量猪只的死亡。
因此，有效地检测和诊断这些病毒对于猪场的健康管理至关重要。
传统的检测方法包括病毒分离、病毒血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等，但这些方法难以准确、高效地检测不同类型的病毒。
因此，研发一种快速、准确、高效的多重PCR检测方法对于猪场中的病毒检测和诊断至关重要。
2. 研究目的和内容本研究旨在建立一种基于多重PCR的病毒检测方法，可以同时检测PRRSV、PCV2和SS2三种病毒。
通过优化PCR反应条件、选择合适的引物和探针，来提高检测的灵敏度和特异性。
同时，对该方法进行初步应用，检测各种可能出现的病毒样本，以评估其应用价值。
具体的研究内容包括：(1) DNA提取和纯化方法，提取和纯化出需要检测的病毒DNA；(2) 多重PCR反应体系和条件的优化，筛选最适合的引物和探针；(3) 建立基于多重PCR的检测方法，并对其进行验证；(4) 对不同来源的样本进行初步的多重PCR检测。
3. 研究方法(1) 样本的收集和处理：收集猪场中可能感染PRRSV、PCV2和SS2的各种病毒样本，如血样和组织样本等，并进行处理和保存；(2) DNA提取和纯化：使用商用试剂盒进行病毒DNA的提取和纯化，检验提取得到的DNA的完整性和质量；(3) 多重PCR反应条件的优化：通过不断尝试调节反应体系等参数，优化多重PCR反应条件，提高检测准确性；(4) 建立检测方法：根据优化后的多重PCR反应条件，建立基于多重PCR的检测方法，并对其进行验证；(5) 样本检测并初步应用：对不同来源的样本进行多重PCR检测，并对检测结果进行统计和分析，以获得初步的有效性评估，了解该方法是否可靠和适用。
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用
临床 样 品快速 鉴 别检 测 。
关键 词 ： 双重 Ｐ Ｃ Ｒ； 高致病 性猪 繁 殖与 呼吸 综合征 病毒 ； 猪 为狂 犬病 病毒
动物 医学 进展 。 ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ １ ０ ） ： ８ ５ — ８ ８
Ｐｒ ｏ ｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄｉ ｃ ｉ ｎｅ
高 致病 性 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 和 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 双重 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 方 法 的建 立及 初 步应 用
程 亮 亮 ， 祁克 宗 ， 占松 鹤 ， 朱 良强 ， 秦 爱建 。
（ １ ．安 徽 农 业 大学 动 物 科 技 学 院 ， 安 徽合肥 ２ ３ ０ ０ ３ ６ ； ２ ．安 徽 省 动 物 疫 病 预 防 与控 制 中 心 ， 安徽合肥 ２ ３ ０ ０ ２ ２ ； ３ ．扬 州 大 学兽 医 学 院 ， 江苏 扬 州 ２ ２ ５ ０ ０ ９ ）
猪伪 狂 犬 病 （Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ，Ｐ Ｒ）是 由猪 伪 狂
犬病 病毒 （Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｐ Ｒ Ｖ）引 起 的一 种
异信 息 ， 在此 基础 上设计 合 成一对 ＨＰ — Ｐ Ｒ ＲＳ Ｖ 的特
异性 检 测引物 ， 再结合根据 Ｐ ＲＶ ｇ Ｂ基 因保 守 序 列
征病毒 （ Ｈｉ ｇ ｈ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｄ
15022263_H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用
猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用吴锦艳;田宏;尚佑军;陈妍;魏衍全;侯相民;赵娜;何建辉;刘湘涛【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2011(042)010【摘要】A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (multiplex RT-PCR) was developed for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Three pairs of primer selected from four pairs were designed based on the sequence of high conservative region of PRRSV. And PCR product was 228, 345 and 490 bp. Diagnostic accuracy of the multiplex RT-PCR shown to be 10-fold more sensitive than the conventional single RT-PCR (conventional RT-PCR) method, and the testing time is shorten greatly. Simultaneously, the specificity and sensitivity of this method were evaluated. The result indicated that this assay could reliably differentiate between PRRSV and other swine viral disease, such as classical swine fever virus (CSFV), porcine rabies virus (PRV). The developed multiplex RT-PCR in this study may provide a new avenue to the rapid detection of this important pathogen in one reaction, which possess the good character in specificity, sensibility,simple and convenient.%本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法.通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490 bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒和组织毒、田间样品及临床症状相似的疾病猪瘟和猪伪狂犬病毒做了检测；并对田间及实验室样品进行符合率试验,对阳性样品进行重复性试验.与常规RT-PCR法进行比较,证明该方法比常规RT-PCR法敏感性提高了10倍；而且利用该方法可使检测时间大大缩短；特异性试验证实该方法无交叉反应；阳性和阴性样本的符合率均为100％；3次阳性样品重复性检测结果完全相同；稳定性试验显示该试剂盒至少可保存1年以上.本研究所建立的PRRSV一步多重RT-PCR检测方法的敏感性高、特异性强、操作简便、省时、结果重复性好,不仅适用于临床病例尤其低微含量样品的诊断,而且在筛查隐形带毒动物及兽医检疫方面具有重要的应用价值.【总页数】6页(P1485-1490)【作者】吴锦艳;田宏;尚佑军;陈妍;魏衍全;侯相民;赵娜;何建辉;刘湘涛【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用 [J], 张坤;何启盖2.一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用 [J], 于新友;李天芝;沈志强3.猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 于新友;李天芝4.捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 刘杉杉;赵亚荣;胡峰;吕超超;胡泉博;王贵华;崔尚金5.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用 [J], 丁庆文;闫晓光;张红垒;李倩倩;张云飞;舒祥力;单法;李林姣;胡慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PRRSV不同毒株RT-PCR检测方法的建立与应用
福建畜牧兽医第42卷第5期2020年1PRRSV不同毒株RT-PCR检测方法的建立与应用饶云萍兆丰华生物科技(福州)有限公司福州350014摘要根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株与流行株NADC30-like Nsp2的特点设计特异性引物，建立能够快速区分这三类毒株的RT-PCR检测方法遥该方法能够对猪繁殖与呼吸综合征病毒的经典毒株、高致病性毒株与NADC30-like流行株扩增出特异性片段,其大小分别为1000bp、900bp和700bp遥具有快速、特异、通用等特点，可用于实验室快速诊断，为该病的诊断及免疫防控提供参考依据遥用本试验所建立的方法对福建省疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的58份样品进行检测，结果显示34份为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，其中高致病性毒株占41.18%,NADC30-like占14.71%,多毒株共感染占35.29%，提示高致病性毒株仍占主导，但多毒株共感染成为流行趋势遥关键词猪繁殖与呼吸综合征经典毒株高致病性毒株NADC30-like文献标识码:A文章编号：1003-4331(2020)05-0001-03Establishment and application of RT-PCR methods for identifying different types of PRRSVRao Yunping(Jofunhwa Biotechnology(Fuzhou)Co.Ltd,Fuzhou350014)Abstract Based on the characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)gene in Nsp2between Classi-cal PRRSV,HP-PRRSV and NADC30-like,one pair of primers was designed and a rapid diagnostic method of RT-PCR was estab-lished.The established method had a rapid and general features and it only amplified target band from PRRSV.A total of1000bp bands were amplified from Classical PRRSV and900bp bands were amplified from HP-PRRSV strains and700bp bands were amplified from NADC30-like strains.A highly special RT-PCR method was established and it can directly differentiate PRRSV,which can be provide reference for diagnosis and the immune ing the RT-PCR method established in this experiment,58sam-ples of suspected PRRSV infections collected from many areas in Fujian were tested.The34PRRSV strains were detected,The detec-tion rate of HP-PRRSV was41.18%,NADC30-like was14.71%,mixed infection was35.29%.The result suggested the HP-PRRSV strains still dominate,but mixed infection with multiple strains has become an epidemic.Key words PRRS Classical PRRSV HP-PRRSV NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征的传染病叭1987年美国首次报道该病，随后欧洲和亚洲等地区陆续报道罠1995年我国首次有关于PRRS的描述,1996年郭宝清等分离确定了引起该疫病流行的病原-PRRSV（CH-1a株）,随后世界各地呈大面积流行，给养猪业造成了巨大的经济损失［3］遥根据该病在我国的流行特点和临床表现，可分为3个流行趋势。
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试验研究猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒
二重RT-PCR检测方法的建立
白 娟1,李广明1,宋勤叶2,李玉峰1,王先炜1,张国龙1,姜 平1*(1.南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095;2.河北农业大学动物科技学院,河北保定 071001)
摘要:根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反
应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286bp和390bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10@TCID50和1@TCID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。关键词:猪脑心肌炎病毒;猪繁殖与呼吸综合征病毒;二重RT-PCR
中图分类号:S851134 文献标识码:A 文章编号:0529-5130(2009)06-0001-04
DevelopmemtofaduplexRT-PCRassayfordetectionofencephalomyocarditisvirusandporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus
BAIJuan1,LIGuang-ming1,SONGQin-ye2,LIYu-feng1,WANGXian-wei1,ZHANGGuo-long1,JIANGPing1*
(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseasesDiagnosticandImmunology,MinistryofAgriculture,CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China)
Abstract:Basedonthesequencesof3Dofencephalomyocarditisvirus(EMCV)andNgeneofporcinereproductiveandrespiratorysyn-
dromevirus(PRRSV),twopairsofprimersweredesignedandsynthesized,andaduplexRT-PCRmethodwasestablishedfordetectionofthetwovirusessimultaneously.TwospecificPCRproducts,286bpforEMCVand390bpforPRRSVinlength,weresimultaneouslyampl-ifiedfromthetwoviruses.Thesensitivityandspecificitytestsshowedthattheassaycoulddetect10TCID50ofEMCVand1TCID50ofPRRSV.Therewasnocross-reactionswiththoseclinicallyrelevantpathogens,ie1porcineparvovirus,porcinepseudorabiesvirus,porcinecircovirustype2,hogcholeravirusandJapaneseencephalitisvirus.Thedetectionresultsfor20clinicalsampleswiththeduplexRT-PCRshowedthat15sampleswerepositiveforPRRSVand3forEMCV,whichwereidenticaltothosewithsingleRT-PCR.ItsuggestedthatEMCVexistsinChinaandtheduplexRT-PCRestablishedinthisstudycouldbeusedasadetectionmethodforcoinfectionswithEMCVandPRRSV.Keywords:encephalomyocarditisvirus;porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus;duplexRT-PCR
脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus,EM-CV)是一种重要的人畜共患病病原,可引起猪和某些哺乳动物、啮齿动物乃至灵长类动物的急性传染病,以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征。EM-CV感染仔猪可造成心肌等实质器官的广泛病理损 收稿日期:2008-11-26基金项目:教育部重点项目(104101)、江苏省科技攻关项目(BE2007342)、教育部博士点基金项目(20060307007)和国家自然科学基金(30871868)。作者简介:白娟(1982-),女,硕士研究生。*通讯作者。伤甚至发生急性死亡,死亡率最高可达100%;可导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍,还可以引起亚临床感染。2005年我国盖新娜等从北京、河北、湖北、辽宁、天津等地猪场分别采集病死仔猪、早产及流产胎儿的组织病料,分离获得EMCV[1],血清学调查显示我国规模化猪场EMCV阳性率较高[2-3]。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是近十年来我国新出现的最重要传染病病原之一,可引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病,表现为母猪为流产、产死
#1#畜牧与兽医 2009年 第41卷 第6期胎、弱胎、木乃伊胎、仔猪体温升高、呼吸困难、急性或亚急性死亡和生长迟缓,现已经广泛流行于世界各地猪群,已给世界养猪业造成巨大经济损失[4]。目前,EMCV和PRRSV感染检测有多种方法,包括病原分离鉴定、病毒中和试验、RT-PCR和ELISA方法等。本研究采用针对EMCV和PRRSV基因的两对PCR引物,经PCR反应条件优化,建立了一种二重PCR检测方法,可同时检测EMCV和PRRSV。该方法简便、快速、特异,可用于该类疾病临床诊断。1 材料与方法111 病毒与临床样品 PRRSVS1株、SY0608毒株、EMCV-NJ08毒株、猪圆环病毒2型(PCV-2)SH毒株、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)由本实验室保存。临床样品为仔猪肺、脾、心脏等组织,分别来自20个发病猪场,发病仔猪主要表现为体温升高、呼吸道疾病和死亡。112 主要试剂M-MLV、OligodT18、dNTPMixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIzol试剂、pMD18-T载体等试剂均购自Invitrogen公司。113 引物设计根据EMCV-3DP1基因[GeneBankno1X74312]设计了一对引物(上游引物:5c-CCCTACCTCACG-GAATGGGGCAAAG-3c;下游引物:5c-GGTGAGAG-CAAGCCTCGCAAAGACAG-3c);根据PRRSV-N基因保守序列[GeneBankno.EV144079]设计了一对引物(上游引物:5c-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3c;下游引物:5c-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3c),引物均由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。114 总RNA提取取EMCV和PRRSV等病毒培养液、病料组织悬液,按照试剂盒说明书,提取总RNA,用DEPC水10LL溶解沉淀,-20e保存或用于RT-PCR检测。115 二重RT-PCR反转录:在20LL的反转录体系中包括:总RNA2LL、5@Buffer4LL、dNTP250nmol/L、M-MLV100U、OligodT181LL(50pmol/L),用DEPC水补至20LL。37e水浴1h,立即用于PCR或置于-20e保存备用。RT-PCR:优化参与反应试剂的最佳浓度和PCR反应参数,在PCR仪上进行DNA扩增。反应总体积为25LL,内含10@PCRBuffer(内含20mmol/LMg+)1~3LL、215mmol/LdNTP1LL、两对引物各015LL(10~20pmol/L)、cDNA模板3LL、1~2U/LLExTaqDNA聚合酶015LL,用水补足,筛选并确定PCR反应参数为:94e2min;然后94e45s、60e45s、72e1min,35个循环,最后72e延伸10min,25e终止反应。扩增产物经115%琼脂糖凝胶电泳分离后于紫外灯下观察,判定结果。116 PCR产物克隆与序列分析将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后,按微量胶回收试剂盒的使用说明回收目的DNA片段,与pMD18-TVector载体连接后转化DH5A,送Invitrogen生物技术有限公司测序,并在NCBI网站上进行BLAST比对分析。117 敏感性试验将10000TCID50的EMCV和1000TCID50的PRRSV混合,10倍比稀释后取200LL,提取RNA进行二重RT-PCR,根据其能检测EMCV或PRRSV的最大稀释度判定该检测方法的最小检出量。118 特异性试验取乙型脑炎减毒活疫苗(JEV)、猪瘟弱毒活疫苗(HCV)、PPV、PCV2、PRV、EMCV和PRRSV,分别提取RNA,进行二重RT-PCR检测,判定其特异性。
2 结果211 PCR反应条件优化 在建立EMCV和PRRSV单一PCR基础上,以
EMCV和PRRSV混合病毒cDNA为PCR模板,选择使用10pmol/L和20pmol/L引物,115、215和3mmol/LMg+,1、2和3UTaqDNA聚合酶,53、55、58、60e退火温度,分别逐一进行PCR反应条件优化,结果见图1,表明二重RT-PCR扩增的DNA条带与单一PCR结果相似,EMCV和PRRSV目的基因大小分别为286bp和390bp,与预期大小相符。
M:DNA分子质量标准;1.PRRSV;2.EMCV;3.EMCV+PRRSV图1 EMCV和PRRSV二重RT-PCR扩增结果
#2#AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine 2009 Vol141 No16