双缩脲法测蛋白质含量
实验一双缩脲法测定蛋白质含量
实验一:双缩服法测定蛋白质含量一目的掌握双缩腺法测定蛍白质含■的原理及方法。
二原理双缩，眠（）是两分于尿素经180°C左右加热,放出一分于氨（NHJ后得到的产物。
在强碱溶液中，双缩關与CUS（h形成紫色络台物，称为双缩腺反应。
其原因是含有两个及以上肽犍或类似肽犍有化台物都具有类似双缩臊反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CM•络台成紫红色的络合物。
其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分于長和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含長。
该法对样品中蛋白质含長要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。
iris （三甲包基氨墓甲烷）、一些氨基酸、EDTA （乙二胺四乙酸）、草二醸胺、多肽等会于扰该测定。
在一定浓度范围內,反应后颜色与被测样品蛋白质含長呈线性关系，即蛋白质浓度越高, 体系的颜色越深。
反应产物在54（）nm处有是大吸收峰（吸光度）。
将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩腺试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含長（浓度）。
由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系奸，故对蛋白质快速而不雷要十分精确的测定可用此法。
三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容長瓶（250 mk 500mk 1000 ml）刻度吸管（1.0ml 2.0 ml 5.0ml）试管（1.5cmX15cm）o 四试剂1、双缩廉试剂称取硫酸铜（CUSSCHQ） 1.5g,酒石酸钾衲（）6-0g,分别用250 ml蒸憎水溶解后，一并转入1000 ml容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 mllO%（质長分数）Na（）H溶液，然后用蒸憎水稀释至刻度（1000m l）0将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。
此试剂可长期保存（须无红色或黒色沉淀出现），长期使用。
蛋白质检测方法双缩脲
蛋白质检测方法双缩脲
双缩脲法（二硫苏糖酸二缩脲法、2,2'-二(硫苯甲醛)-4,4'-二缩脲化合物法）是一种常用的蛋白质定量方法。
该方法是利用蛋白质和双缩脲在碱性条件下反应生成紫色产物，通过测量产物的吸光度可以确定蛋白质的含量。
具体操作步骤如下：
1. 将待测样品（蛋白质溶液）和双缩脲试剂按一定比例混合，并在碱性条件下孵育反应一定时间（一般为10-30分钟）。
2. 反应完成后，用酸性溶液停止反应，并将溶液转移到透明的96孔板中。
3. 使用光谱仪或分光光度计测量透明板中每个孔的吸光度（可以在450 nm波长下测量）。
4. 将吸光度数据与标准曲线进行比较，即可确定样品中蛋白质的含量。
需要注意的是，双缩脲法是一种相对定量方法，其结果仅供参考。
如果需要精确测量蛋白质的含量，建议使用比较准确的定量方法，如BCA法或Bradford法等。
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
实验一:双缩脲法测定卵白质含量之蔡仲巾千创作一目的掌握双缩脲法测定卵白质含量的原理及方法.二原理双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后获得的产物.在强碱溶液中, 双缩脲与CUSO4形成紫色络合物, 称为双缩脲反应.其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应.卵白质含有多个肽键, 在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物.其颜色的深浅与被测样品中卵白质浓度呈正比, 而与卵白质分子量和氨基酸成份无关, 故可用来测定卵白质含量.该法对样品中卵白质含量要求相对较高, 一般在1—10mg/L卵白质.tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定.在一定浓度范围内, 反应后颜色与被测样品卵白质含量呈线性关系, 即卵白质浓度越高, 体系的颜色越深.反应产物在540nm 处有最年夜吸收峰（吸光度）.将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准卵白质溶液同时与双缩脲试剂反应, 并在540nm处比色, 可通过标准浓度卵白质绘制的标准曲线, 求得未知样品中的卵白质含量（浓度）.由于本法把持简便、迅速、卵白质浓度与光密度的线性关系好, 故对卵白质快速而不需要十分精确的测定可用此法.三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）.四试剂1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g, 酒石酸钾钠（）6.0g, 分别用250 ml蒸馏水溶解后, 一并转入1000 m l容量瓶中, 在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液, 然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）.将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内.此试剂可长期保管（须无红色或黑色沉淀呈现）, 长期使用.2、0.05 ml/L的NaOH（需标定）.3、标准酪卵白溶液准确称取0.5 g酪卵白（干酪素）溶于0.05 ml/L的NaOH溶液中, 并定容于100ml, 即为5mg/L的标准溶液.4、未知卵白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内.可根据条件选用小麦粉或家畜血清, 后者需用水稀释10倍, 置于冰箱保管备用.五方法与步伐1、标准曲线的绘制取12支试管分两组, 分别加入0.0ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8ml、1.0ml的标准卵白质溶液, 然后分别加入1.0ml、0.8ml、0.6 ml、0.4 ml、、0.2ml、0 .0ml蒸馏水, 使每支试管总液量为 1.0ml, 最后分别加入 4 ml双缩脲试剂.充沛摇匀后, 室温下（20—25℃）放置30min, 于540nm处进行比色测定, 用未加卵白质溶液的第一支试管作为空白对比液, 并取两组测定的平均值.以卵白质的含量作为横坐标, 光吸收值为纵坐标绘制标准曲线.标准曲线绘制把持表见下.（共12支管, 分两组, 只列出一组.）2、样品测定（1）小麦样品的制备与测定①将磨碎过100目筛的小麦样品在80℃下烘至恒重, 取出置于干燥器中冷却待用.②称取烘干样品约0.2g两份, 分别放入两个干燥的三角瓶中.然后各瓶加入5 ml0.05 ml/L的NaOH溶液湿润, 之后再加入场20 ml的双缩脲试剂（为什么？）振荡15 min, 室温静置反应30min, 分别过滤（为什么？）, 取滤液在540nm波长处比色, 在标准曲线上查出相应的卵白质含量（mg）（为什么？）.（2）家畜血清样品的制备与测定①对植物空腹采静脉血, 不加抗凝剂（为什么？）在室温与待自行凝固（5--10 min）, 通常经3h, 血块收缩析出血清.析出血清后及时分离之, 以防溶血,并稀释10倍置于冰霜保管.②取两份血清, 每份 1.0ml, 分别加入 4 ml双缩脲试剂, 摇匀, 37℃（为什么？）, 20 min后用分光光度计于540nm波长处比色, 在标准曲线上查出相应的卵白质含量.（3）每次测定中须用空白管调零.六结果处置从标准曲线上查得的卵白质含量（mg）样品卵白质（%）=—————————————————X100X酪卵白的纯度样品重（mg）测定管光密度100 测定管光密度被测血清总卵白质（g/100ml）=———————X0.05 X———=———————X5标准管光密度0 .1 标准管光密度七注意事项1、三角瓶一定要干燥, 勿使样品（小麦粉）粘在瓶壁上.2、若用小牛血清（BSA）卵白质含量（mg/ml）应以1mg/ml的A540（540nm波长吸光度）为0.66来校正其纯度.3、测定管与第6管把持同.八思考题1、分光光度法基来源根基理是什么？2、双缩脲测定卵白质含量的原理是什么？3、为什么双缩脲法简便、快速而准确性不高？。
双缩脲加分光光度法测蛋白质含量
5、待检测样品的测定。
试剂
管号
待测样品（ml）
1 （脱脂牛奶）
3.0
3 （含乳饮品）
3.0
双缩脲试剂A(ml)
1.0
1.0
双缩脲试剂B(ml)
1.0
1.0
水浴加热20min，充分混匀，在540nm比色。
A540nm
0.463
0.239
4 （牛奶）
3.0 1.0 1.0
2.695
利用相关电脑软件制作标准曲线，并对照标准曲线比较待测饮品中蛋白质浓度高低。
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲(H2N-0C-NHC0-NH2) ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶 液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键(-CO-NH-),同 样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的 紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量 在10~120g/L范围内有良好的线性关系。
双缩脲试剂的使用：使用时先在待测液体中加入双缩脲试剂A，再 加入等量的双缩脲试剂B，摇匀。
2、2mg/ml标准蛋白的配制。
精确称取牛血清白蛋白0.1g，在小烧杯内搅拌溶解。再转移到50ml容量瓶 中，定容。
3、标准曲线的绘制 取干净试管7支，编号，按表1进行操作。
管号 试剂
0
1
2
3
2mg/ml牛血 清白蛋白
六、实践活动评价
由实验结果可知：蛋白质含量脱脂牛奶>含乳饮品>纯牛奶。 与预期实验结果符合。
0.0
0.3
0.6
0.9
蒸馏水/ml
3
2.7
2.4
2.1
蛋白质浓度/ （mg/ml）
大学精品课件：实验3-双缩脲法测定蛋白质含量
样品（ml）
—
—
1.0
H2O(ml)
2.0
1.0
1.0
双缩脲试剂（ml） 4.0
4.0
4.0
室温放置30分钟，于540nm处比色
实验注意事项
1、试管要洗干净
2、取样要准确
3、加样顺序不可颠倒
4、各管试剂加完后要立即混匀
5、显色后放置时间不可太短或过长源自6、仪器在使用前要预热和校准
课后练习
1、描述五种蛋白质浓度测定方法的优缺 点、灵敏度和原理。
比
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式 (A)
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A ⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测
样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。
光路
返回
光路
返回
返回
在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋 白质溶液同时反应，并于540～560nm下比色，可 以通过标准曲线法或对照法求出未知样品的蛋白质 浓度。
Cu2+ 紫红色络合物
(碱性溶液)
蛋白质在碱性溶液中也 能与硫酸铜发生相同反应， 产生紫红色络合物。
实验操作
试管编号
1
2
3
标准蛋白（ml）
—
1.0
—
2．常用方法 （1）标准曲线法
▪ 标准曲线与样品的测定条件必须一致。
（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法
双缩脲法测定蛋白质的含量心得体会
双缩脲法测定蛋白质的含量心得体会蛋白质是组成人体的重要物质，也是构成细胞的基本单位。
对生命活动起着决定性作用。
一、双缩脲法测定蛋白质的含量检验原理蛋白质分子在加热时失去一个氨基酸残基或几个羧基残基，可与浓硫酸作用产生红色的硫酸铵，故在反应后滴加碱液可以消除这种颜色，最终的颜色变化和硫酸铵的存在有关。
反应机理是：先是双缩脲中的氮原子与四氯化碳反应，生成橙黄色的醌式结构，这是一种较稳定的化合物，不易被破坏；然后与氨水反应，得到淡黄色的 N-氨基- N-乙酰氨基脲衍生物，后者再与亚硝酸钠作用，就生成蓝紫色的物质；最后双缩脲与盐酸羟胺反应，又生成红色的络合物，从而消除了试样中未参与反应的四氯化碳所引起的颜色。
在实际工作中，常用中性或弱碱性的氢氧化钠溶液来代替稀硫酸作为反应的溶剂，并且滴加的碱液总量比用双缩脲测定蛋白质含量的需要多出2～3倍左右。
影响因素当 pH 值在7.5左右时，加入中性或弱碱性的氢氧化钠溶液后，随着反应的进行，氢氧根离子浓度逐渐减小，而亚甲基的电离度却增大（如图），导致反应过程中平衡向生成盐的方向移动，直至生成白色沉淀为止。
蛋白质分子为何会发生加聚反应？蛋白质分子由于高温使其中间部位的肽键断裂而形成二聚体。
蛋白质分子之间相互作用力极强，二聚体的分子内能降低，故不易继续维持其天然状态，需经热处理才能恢复到原始的三聚体状态。
在加热时由于水解，或发生一些副反应等原因，往往使反应速率缓慢下来，当达到某一点后，停止加热，如果分析条件适宜，便可发现二聚体，但此时它已不能被测定。
故通常将二聚体在70℃下加热10分钟，使其完全水解。
注意事项在做双缩脲反应时，必须严格控制反应条件，尤其是 PH 值，否则很容易造成二聚体，导致测定失败。
实验八 双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量
实验十一双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量一、目的要求1．学习双缩脲法的基本原理及操作。
2．通过实验学会制作标准曲线。
二、实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。
测定范围为1－10mg蛋白质/ml。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、操作方法：1．标准曲线的制作。
酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH 做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。
）管号 1 2 3 4 5 6酪蛋白(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2蒸馏水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0双缩脲试剂(ml) 3 3 3 3 3 3混匀，放置30分钟A540 0计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。
）混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。
四、样品处理1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。
）；2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；3．离心，4000rPm，离心15分钟；4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。
双缩脲法测定蛋白质实验报告
双缩脲法测定蛋白质实验报告
蛋白质的双缩脲法测定是常见的生物化学实验。
它是用来测定有机物中大量焦磷酸核苷（DNS）和蛋白质的10比热容变（TN）的定性分析试验。
一般根据实验结果，可求出有机物中蛋白质的含量。
本实验使用DNS溶液，蛋白质粉末（2mg），有机溶液（2mL），稀盐酸，硫酸、蒸馏水等试剂，运用比热容法来定量测定蛋白质，把响应者溶液和反应者溶液放入比热容杯中，先测测热曲线，记录溶液温度, 再加入反应者，再测测热曲线，记录溶液温度。
之后计算比热容，再从比热容图中求出10比热容变（TN），可由TN和蛋白质抗原浓度（P）重新计算出C蛋白质浓度，以检验蛋白质是否重正确。
本实验首先将22.725mL的2mol/L的硫酸溶液加入比热容杯中，用比热容仪对其温度变化进行测定，测得TN值为10.27 J/g•°C。
然后将8mg的蛋白质粉末和2 mL的稀盐酸中加入到比热容杯中，再测定温度，得到TN值为20.72 J/g•°C。
最后，将TN值相减，得出蛋白质的10比热容变（TN）值为10.45 J/g•°C，根据 TN与P的关系，得出蛋白质浓度C 为1.575mg/mL。
试验结果表明，采用双缩脲法测定有机物中蛋白质的含量是简单、准确、快捷的方法，可以更有效地进行蛋白质测定实验。
蛋白质的定量测定(一)——双缩脲法
【实验原理】 实验原理】
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩 脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与 Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质 浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。
N H C O N H N H C O N H
2 2 2 2
N H C
1 8 0 加 热
o
2
O N H +N H
Lambert-Beer定律（又称吸收定律） 定律（又称吸收定律） 定律
上二式合并（即（l）与（2）合并） lg（ I0 /I） = εCL 令A= lg（ I0 /I） ， T= I / I0 ；则 A=εCL， A=-lgT 。 T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。 其中ε为常数，又称消光系数（extinction coefficient），表示物质对光线吸收的能力，其值因 物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波 长的单色光则消光系数不变。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种， 目前测定蛋白质含量的方法有很多种， 下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋 白质测定方法： 白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法。 物理性质：紫外分光光度法。 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法等。 法等。 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 其他性质：免疫比浊法。 其他性质：免疫比浊法。
3.结果
由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。 由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以mg/ml 计。
【注意事项】 注意事项】 1．本实验方法测定范围1－10mg/ml蛋白质。 ．本实验方法测定范围 － 蛋白质。 蛋白质 2．各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 ．各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 3．有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑 ．有大量脂肪性物质同时存在时， 浊的反应混合物， 浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使 溶液澄清后离心，取上清液再测定。 溶液澄清后离心，取上清紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
双缩脲法测定蛋白质含量精编资料
双缩脲法测定蛋白质含量实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1～10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材[试剂]1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
[器材]1．试管：15×150mm 试管7只；2．1ml，5ml移液管；3．坐标纸；4．721分光光度计。
四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作：混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。