(完整版)细胞增殖的练习题及答案
细胞的增殖作业
一、选择题：
1、在一个细胞周期中，最可能发生在同一时期的是（）
A．着丝点的分裂和细胞质的分裂 B．染色体数加倍和染色单体形成
C．细胞板的出现和纺锤体的出现D．染色体复制和中心粒复制
2．科学家用15N的硝酸盐作为标记物浸泡蚕豆幼苗，追踪蚕豆根尖细胞分裂情况，得到蚕豆根尖分生区细胞连续分裂数据如下，则下列叙述正确的是（）
A．高尔基体、线粒体、叶绿体在蚕豆根尖细胞分裂过程中活动旺盛
B．蚕豆根尖细胞的DNA分子结构稳定性最低的时期有0—2h、19.3—21.3h、
38.6—40.6h
C．基因重组可发生在19.3—21.3h
D．蚕豆根尖细胞分裂的一个细胞周期为19.3h
3．下列有关“观察植物细胞有丝分裂”实验现象的叙述，其中错误的是（）A．分生区的细胞呈正方形
B．根尖的整体呈乳白色，尖端（根冠）略显淡黄
C．处于分裂前期的细胞均无核仁
D．向左下方略移动装片，图像向右上方移动
4．种子萌发时，在利用光能之前，不会发生下列哪种现象（）
A．细胞分化B．细胞分裂
C．细胞呼吸D．利用无机物合成有机物
5．有关细胞分化的叙述，正确的是（）
A．分化只发生在人的胚胎时期
B．分化过程中，细胞器种类和数量不会发生改变
C．分化过程中遗传物质发生了改变
D．生物体生长发育过程是细胞发生分化的过程
6．癌细胞属于恶性分化的细胞，表现为（）
A．细胞表面糖蛋白减少B．存在大量游离核糖体
C．细胞代谢速率下降D．细胞含水量急剧下降
7．下图中甲—丁为某动物（染色体数=2n）睾丸中细胞分裂不同时期的染色体数、染色单体数和DNA分子数的比例图，关于此图叙述中错误
．．的是（）
A．甲图可表示有丝分裂前期B．乙图可表示减数第二次分裂前期
C．丙图可表示有丝分裂后期D．丁图可表示减数第二次分裂末期8．用高倍显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂。下列叙述正确的是（）A．处于分裂间期和中期的细胞数目大致相等
B．视野中不同细胞的染色体数目可能不相等
C．观察处于分裂中期的细胞，可清晰的看到赤道板和染色体
D．细胞是独力分裂的，因此可选一个细胞持续观察它的整个分裂过程
9．菠菜根的分生区细胞不断分裂，对该过程的叙述正确的是（）A．细胞分裂间期，DNA复制，DNA和染色体的数目增加一倍
B．细胞分裂前期，核膜和核仁逐渐消失，中心体发生星射线形成纺锤体
C．细胞分裂中期，染色体形态固定、数目清晰，适于染色体计数和形态观察D．细胞分裂末期，在细胞中央赤道板的位置出现一个由薄细胞构成的细胞板10．处于有丝分裂过程中的动物细胞，细胞内
的染色体（a）数、染色单体（b）数、DNA
分子（c）数可表示为如图所示的关系，此
时细胞内可能发生（）
A．中心粒发出星射线
B．染色体的着丝点分裂
C．细胞板形成
D．DNA的复制
11．取生长健壮的小麦根尖，经过解离、漂洗、染色、制片过程，制成临时装片，放在显微镜下观察。欲观察到细胞有丝分裂的前、中、后、末几个时期，则（）
A．应该选一个处于间期的细胞，持续观察它从间期到末期的全过程
B．如果在低倍镜下看不到细胞，可改用高倍镜继续观察
C．如果在一个视野中不能看全各个时期，可移动装片从周围细胞中寻找
D．如果视野过暗，可以转动细准焦螺旋增加视野亮度
12．下列表示四种植物细胞的细胞周期，如果从四种细胞中选择一种用来观察细胞的有丝分裂，最好选用
（）
13．下列关于细胞分裂和分化的叙述，不正确的是
（）
A．在生物的一生中，细胞分裂旺盛的时期是胚胎期和生长发育期
B．细胞分化是细胞形态、结构、功能发生持久、不可逆转的稳定性变化
C．在生物的个体发育过程中，既有细胞的分裂又有细胞的分化
D．高度分化后的细胞遗传物质发生了改变
14．下列关于细胞分裂、分化、衰老和死亡的叙述，正确的是（）
A．细胞分化使各种细胞的遗传物质有所差异，导致细胞的形态和功能各不相同
B．个体发育过程中细胞的分裂、分化和死亡对于生物体都是有积极意义的C．细胞分裂存在于个体发育整个生命过程中，细胞分化仅发生于胚胎发育阶段
D．多细胞生物细胞的衰老与机体的衰老总是同步进行的
15．在下列细胞的分裂过程中，用显微镜能观察到染色体的是
（）
A．蛙的红细胞B．蓝藻细胞C．硝化细菌细胞D．根尖分生区细胞
16．若用化学药剂抑制肿瘤细胞的DNA复制，这些细胞就停留在（）A．分裂期前期B．分裂期中期 C．分裂期后期D．分裂间期
17．在细胞有丝分裂的分裂期开始时，如果它的染色体数为N,DNA含量为Q,则该细胞分裂后每个子细胞中的染色体数和DNA含量分别是（）
A．N和Q B．N/2和Q/2
C．N和Q/2 D．N/2和Q
18．关于人体癌细胞的叙述，不正确的是（）A．细胞癌变主要是因为原癌基因和抑癌基因发生突变
B．癌细胞比所有正常细胞分裂周期长、生长快
C．有些病毒能将其基因整合到人的基因组中，从而诱发人的细胞癌变
D．癌细胞的形态结构和表面的物质都发生明显的变化
19．下列实验与其所用试剂搭配错误的是
（）
A．在观察植物细胞有丝分裂实验中，使用醋酸洋红溶液使染色体着色
B．在提取叶绿体色素实验中，使用乙醇提取色素
C．观察线粒体在细胞中分布的实验中，染色液为健那绿
D．在蛋白质的鉴定实验中，使用苏丹Ⅲ染液鉴定蛋白质
20．下列哪种细胞的全能性最容易表达出现（）A．青蛙的上皮细胞B．胡萝卜的韧皮部细胞
C．大白鼠的肝脏细胞D．人皮肤生发层细胞
21．细胞的全能性是指（）
A．细胞具有全面的生理功能
B．细胞既能分化，也能恢复到分化前的状态
C．已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能
D．已经分化的细胞全部能进一步分化
22.下图表示一个细胞有丝分裂过程中染色体变化的不同情况，在整个细胞周期
中，染色体变化的顺序应该是（）
A.①④⑤③②
B.②③①④⑤
C.①⑤④③②
D.⑤④③②①
123
23.下列有关衰老细胞特征的叙述，不正确的是（）
A．衰老的细胞新陈代谢速率加快 B．在衰老的细胞内有些酶的活性降低C．衰老的细胞呼吸速率减慢 D．细胞膜通透性改变，使物质运输功能降低二、非选择题（共55分）
24．（8分）放射性同位素自显彰技术被用于研究细胞有丝分裂过程中DNA 和RNA的变化。下图表示洋葱根尖细胞处于有丝分裂各阶段细胞中DNA和信使RNA的含量变化。请据图回答有关问题：
（1）在放射性同位素标记研究中，为区别DNA和RNA，最好选择标记的合成原料依次是和，研究中应选择的测量材料是洋葱根尖的部位。
（2）在细胞分裂的a时期细胞中的mRNA主要用于指导与有关的蛋白质的合成。能抑制DNA复制的药物作用的时期是。（从a~e中选填）
（3）图示c时期细胞核DNA、染色体与染色单体比例为，这种比例将维持到细胞分裂的期才可能开始变化。
（4）依据图示，细胞中核糖体活动旺盛的时期可能是（从a~e中选填）
25.(4分）右图是一个植物细胞有丝分裂的示意图，据图回答问题：
（1）此细胞处于有丝分裂的_______期。
（2）该细胞此时有_______条染色体，________条染色单体，________个染色体DNA分子。
（3）此细胞分裂结束以后，子细胞内的染色体有_________条。
（4）此时期继续发展，将在赤道板位置出现________，逐渐扩展形成_______，最终分裂为两个子细胞。
一、选择题
1.D
2.D
3.C
4.D
5.D
6.A 7 C 8．B 9．C 10．C 11．A 12．C
13．B 14．B 15．A 16．C 17．D 18．D 19．B 20．B 21．D 22．C
23. B 24．D 25．D 26．B 27．B 28.C 29. C 30.A
二、非选择题
31．（8分）（1）胸腺嘧啶脱氧核苷酸；尿嘧啶核糖核苷酸；分生区；
（2）DNA 复制；b ；
（3）2：1：2；后；
（4）a 、c
32．（共12分，每空2分）
（1）举例正确即得2分
（2） RNA 蛋白质（或DNA 复制或有关 蛋白质的合成） 脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸（缺一不得分）
（3）A 基因的选择性表达 遗传机制决定的编程性死亡
33．（16分）
（1）卵巢和精巢 4×10－3 该浓度下既保证了染色体形态的正常，又使细胞分裂处于中期的细胞比例最高。
（2）104 出现52个四分体的细胞数目最多（而出现其他数目四分体的细胞数目极少）
（3）C （1分） 使青虾组织细胞分散成单个细胞，便于制片观察 G （1分） 使青虾组织细胞内的染色体被染色而便于观察
34．（4分）（1）后 （2）8 0 8 （3）4 （4）细胞板 新的细胞壁
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细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
Brdu细胞增殖检测实验
Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细
2019版1第4单元第1讲细胞的增殖
2019版1第4单元第1讲细胞的增殖 第1讲 细胞的增殖 考点一| 细胞生长和增殖的周期性 (对应学生用书第69页) [识记—基础梳理] 1．细胞的生长 (1)模拟探究实验 ①细胞模型：不同大小的琼脂块。 ②运输效率表示法：NaOH 在琼脂块中扩散体积整个琼脂块的体积 。 ③检测方法：酚酞遇NaOH 呈紫红色。 ④实验结论 A 、在相同时间内，NaOH 在每一琼脂块内扩散的深度基本相同，说明NaOH 在每一琼脂块内扩散的速率是相同的。 B 、琼脂块的表面积与体积之比(相对表面积)随着琼脂块的增加而减小。 C 、NaOH 扩散的体积与整个琼脂块的体积之比随着琼脂块的增大而减小。 (2)细胞不能无限长大的原因 ①细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输效率就越低，因而限制了细胞的长大。 ②细胞核是细胞的控制中心，细胞核中的DNA 不会随着细胞体积的扩大而增加。如果细胞太大，会造成细胞核负担过重。
2．细胞增殖的周期性 (1)细胞周期 ①条件：连续分裂的细胞。 ②组成：细胞周期＝分裂间期＋分裂期。 (2)细胞增殖(真核细胞)的概述 ①方式：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。 ②过程：包括物质准备和细胞分裂整个连续的过程。 ③意义：是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。 [辨析与识图] 1．判断正误 (1)细胞体积增大，与外界物质交换效率提高。(×) 【提示】细胞体积增大，表面积与体积的比值减小，与外界物质交换效率降低。 (2)所有的细胞均有细胞周期。(×) 【提示】连续分裂的细胞才有细胞周期。 (3)洋葱的表皮细胞比分生区细胞的增殖周期长。(×) 【提示】洋葱表皮细胞无细胞周期。 (4)进行减数分裂的细胞不具有细胞周期。(√) (5)人体所有细胞的细胞周期持续时间相同。(×) 【提示】不同细胞的细胞周期持续时间可能不同。 2．据图思考 由细胞形态判断，以下①～⑤细胞中哪一类细胞最可能具有细胞周期？ 【提示】②。 [理解—深化探究]
《细胞增殖》第1课时-细胞增殖实验
《细胞增殖》第1课时|细胞增殖实验 一、教材内容分析（一）教学内容的地位《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。（二）教学目标1、知识目标知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。应用有丝分裂过程各时期的特点。2、能力目标1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。3）情感目标细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。（三）教学重点、难点1、教学重点真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。2、教学难点真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。 二、教学对象分析首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。三、教学时间安排由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。四、教法和学法学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教
细胞增殖MTT检测经验总结
细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：
第一节细胞增殖的教学设计
第一节《细胞的增值》的教学设计 孝义三中高一生物组孟春香 一、教材分析分析 本节课是人教版普通高中生物必修1《分子与细胞》第六章第一节的内容。本节主要讲述了细胞的增值、细胞周期、有丝分裂与无丝分裂，是以后学习减数分裂和遗传规律的基础，也为后面的细胞分化、细胞的衰老和死亡打下铺垫。本节课涉及到的内容与前几章所学的细胞器功能的知识融会贯通，进一步掌握以往的知识，有利于学生用学过的知识解释生命现象，在教材中起着重要的作用。 本节的核心问题如下： 1.细胞问什么不能无限长大呢？ 2.细胞通过什么方式增值？主要方式是什么？什么叫细胞周期？ 3.细胞有丝分裂的过程是怎样的？它有什么生物学意义？ 二、学生分析 因为高一年级的学生生物学基础知识很少，因此，要像对初学生物学的学生那样对待。在教学过程中可以利用前五章学生对于细胞的结构和功能的学习展开，通过适当的策略使新知识融入到原有的知识网络中。虽高一的学生已有较强的抽象思维能力与综合思维能力，但本节内容确实抽象，估计学生对细胞分裂过程中DNA和染色体数的变化难理解，对于有丝分裂各个过程所出现的一系列现象，学生可能仍无法想象清楚，或无法将几个时期的事件串联成一条直链，因此，在教学中可用课件演示的方式使抽象的内容具体化，连续化，复杂的问题简单化。令教学中充分体现以问题解决为核心的课改理念，体现学生的主体地位和教师的主导地位，调动学生的积极性。 三、教学目标 （1）细胞增殖的方式和意义。 （2）细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂的过程。 （3）理解植物细胞有丝分裂过程中染色体、DNA的变化规律。 （4）能够通过小组讨论和总结发言体验合作学习的过程和方法。 （5）通过有丝分裂动画的展示培养观察和获取信息的能力。 （6）养成质疑、严谨、求实、创新及勇于实践的科学态度和科学精神。 四、教学重点与难点 1.教学重点 （1）细胞生长和增殖的周期性。 （2）真核细胞有丝分裂的过程。 2.教学难点 真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体行为和数目的变化，以及DNA数量的变化。 3.学生学习重点 （1）细胞为什么要进行分裂？ （2）细胞有丝分裂的过程是什么？ 4. 学生学习难点
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验 一．实验原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制 将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。 三．实验步骤 1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清， 正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。 2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性 测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。） 3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基 稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含 0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结 晶的生成。 4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解， 室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。 5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复 实验，以保证结果的准确性。
细胞cck 检测实验
细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清液； 8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率 抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100% 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 CCK8对照组的设置及测定的注意事项
MTS细胞增殖检测方法
MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4204-1 BB-4204-2 BB-4204-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays MTS溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： BestBio贝博MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul MTS溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定490 nm各孔的吸光值。 5、同时设置空白孔（培养基和MTS溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和MTS溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。 结果分析 ： 细胞活力计算： 将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例(例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加MTS试剂培养一定时间后测定O.D值， 制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入MTS后的培养时间)。
细胞增殖实验word版
细胞增殖检测方法 细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。 1.DNA合成检测 这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 2.代谢活性检测 检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。 四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、
细胞增殖检测MTT法
细胞增殖检测：MTT法 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025 IC50=0.00025
Brdu细胞增殖检测实验
B r d u细胞增殖检测实验 Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-
Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 1．铺细胞，每个 dish 10万个，在37℃、5%CO2孵箱中培养72h（细胞密度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：L的硼酸钠（）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m） 6．加入1ml的%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育 1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。
EDU-细胞增殖检测
荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例) 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基； 注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10~50 μM)，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1~10μM)； 2)如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。 表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考 注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间； 2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)； 1.3 PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 表2 EdU孵育时间设定参考
注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。 表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考 注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化 2.1 每孔加入50μL 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。 2)可采用其他方式进行细胞固定。 2.2 每孔加入50μL 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
WST-1细胞增殖检测方法
WST-1细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4203-1 BB-4203-2 BB-4203-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays WST-1溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： WST-1是广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。WST-1使用时无须同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan。WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。 图1、WST-1检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂) 使用方法： 1、加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填 充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul WST-1溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定450 nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用430-480nm的滤光片。 5、同时设置空白孔（培养基和WST-1溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和WST-1 溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。
第一节 细胞增殖 教学设计 教案
教学准备 1. 教学目标 1.简述细胞的生长和增殖的周期性。 2.描述细胞的无丝分裂。 3.概述细胞的有丝分裂过程。 2. 教学重点/难点 教学重点： 真核细胞有丝分裂的细胞周期和有丝分裂的过程。 教学难点： 真核细胞有丝分裂的细胞的染色体形态、数目、位置和运动的变化是一个动态而又微 观的过程。 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 教学过程设计 （一）、导入新课 [师]从细胞水平来看，一个蛙的受精卵需要怎样的途径才能成为一只成蛙呢？ 学生小组讨论、代表回答：需要不断进行细胞体积的扩大与细胞分裂，还要细 胞的分化等。 [师]细胞生物学的研究也证明了以上观点，生物体的体积增大，即生物体的生长，既靠细胞生长增大细胞的体积，还要靠细胞分裂增加细胞的数量。事实上，不同生物同类器官或组织的细胞大小一般无明显差异，器官大小主要决定于细 胞数量的多少。
（二）、细胞不能无限长大 [师]细胞为什么不能无限长大？什么因素限制了细胞的长大？ [生]细胞体积越大，需要的营养物质越多，需要排出的代谢废物也越多，物质的输入和输出也会遇到困难。 [师]随着细胞的长大，细胞膜的面积不是也在扩大吗？下面通过模拟实验来探讨这个问题。 学生分组实验：①将实验桌上准备好的琼脂块（内含酚酞）切成边长分别为 25px、2 cm、3 cm的立方体；②将以上三种琼脂块样品，同时置于盛有适量0.1%的NaOH溶液的烧杯中，处理10 min；③取出琼脂块样品，吸干浮液后，分别将每一样品切成两半，观察切面，测量每一切面上NaOH扩散的深度并记录数据。 学生活动：各小组对实验采集的数据进行讨论分析，小组代表陈述观点。 分析： （1）琼脂块的边长越长，NaOH在琼脂块中的扩散效率越差。 （2）边长为3 cm、2 cm、1 cm的琼脂块分别看作三个植物细胞的话，那么细胞表面积与体积的比值是依次增大的。 （3）因而，我们有理由相信，生物的异常旺盛的代谢与其细胞的S/V相对直接有关。细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输的效率就越低。 [师]细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大。可见，生物体的长大主要靠细胞的数量增多，即细胞的增殖来实现。 （三）、细胞周期 [师]细胞以分裂的方式进行增殖。 [师]像草履虫、变形虫这些单细胞生物，细胞分裂有什么作用呢？ [生]通过细胞分裂可以产生后代，起到生殖和繁衍种族的作用。 [师]对多细胞生物来讲，细胞分裂又有什么作用呢？ [生]细胞分裂可以增加体细胞的数目，是细胞分化、组织与器官形成的基础。 [师]细胞的增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理方法及注意事项
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理 Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖与 毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析。 用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8的优点: ?使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂; ?CCK-8法能快速检测; ?CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度; ?CCK-8法的重复性优于MTT 法; ?CCK-8法对细胞毒性小; ?CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。 CCK8的缺点: ?与MTT法相比,CCK8与XTT的价格比较贵。 ?CCK8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。 与以往的增殖/毒性测定试剂相比较: 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差(需加有机好好好
溶性溶剂溶解) 产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液 使用方法配成溶液后 使用 现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高 检测时间较长较短较短最短 检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm 细胞毒性高,细胞形态 完全消失很低,细胞形 态不变 很低,细胞形 态不变 很低,细胞形 态不变 试剂稳定性一般较差一般很好 批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷 二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法 实验一:细胞增殖分析 1、制备细胞悬液:细胞计数 2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。 4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。 5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。 6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。 实验二:细胞毒性分析 1、制备细胞悬液:细胞计数 2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
整理)mts细胞增殖及毒性试验
MTS 或CCK8细胞增殖及毒性试验 一、所需试剂 1、CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒（-20℃避光保存，4℃保存6周，黄色） （1）MTS：新一代四氮唑蓝盐化合物，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成有色的甲瓒产物，其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。 （2）PES：吩嗪硫酸乙酯，一种电子偶联剂，具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS 混合形成稳定的溶液 2、Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）（保存条件同上，紫色） （1）WST-8：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐 （2）1-Methoxy PMS：1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯 3、药物或毒素（药物IC50等用到） 4、96孔板 二、实验步骤 1、种板（96孔板）（个/孔），先配总管再加样（多算5孔的量来配总管，以免不够用） （1）细胞增殖实验：设置NC组，处理组，空白组，6天时间，平均每孔1000-2000个细胞 （2）毒性或药物或放疗IC50：设置梯度给药组（包括不给药组），空白组，平均每孔5000-8000个细胞 2、在37°C，5% CO2的环境下培养 （1）增殖：8h或24h（细胞贴壁时间）,也可种板后直接测第一次，作为基准线，之后每隔24小时检测下一天的细胞量（MTS 每孔加20μl，CCK8加10μl） （2）毒性和药物：培养24h后加入药物培养48小时及以上 3、增殖实验每天测量一次，以100全培养基：20MTS比例配制总管（CCK8以100:10） 4、吸掉96孔板内待测孔内培养基，每孔加入120μl稀释后的MTS试剂（CCK8加入110μl） 4、在37°C，5% CO2的环境下孵育1-4个小时（一般选2h） 5、选取波长，MTS选492nm，CCK8选450nm，读取吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，每日吸光值/基准值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 三、注意事项 1、CCK8原理 WST-8在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比 2、整个过程不可产生气泡，以免对测光产生影响 3、如果需要以后检测每孔加入 25ul 10% SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中最多可保存18小时
MTT实验法测定细胞增殖
MTT实验法测定细胞增殖 1.实验材料 1.1. 实验细胞株 癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。 1.2 药物与试剂 RPMI-1640 培养基 DMSO 胰蛋白酶粉 1-甲基乙内酰脲5-氟尿嘧啶 MTT 粉甘油 碘化丙啶(PI) 新生小牛血清 1.3 仪器设备 超净工作台（SW-CJ-2FD 型）超低温电冰箱恒温水浴箱 低温高速离心机恒温震荡摇动床 -20℃电冰箱光学显微镜电子天平Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul）去离子纯水仪流式细胞仪低温数控高速离心机普通离心机 1.4 主要试剂配方 1.4.1 PBS 溶液 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为1.0L。再使用盐酸将PH 值调至7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。临用前要在37℃水浴加热。 1.4.2 细胞培养基 称取RIPM-1640 培养基粉10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入2g NaHCO3，再用盐酸将PH 值调整至7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为10%。每次临用前要将含有10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于37℃水浴箱中加热。 1.4.3 新生小牛血清 临用前，将新生小牛血清置于56℃水浴中灭活30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。 1.4.4 胰蛋白酶 在100ml 的PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉0.25g，置于4℃冰箱中过夜，用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于4℃冰箱中保存。 1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml) 往50ml 无菌PBS 中加入250mg MTT 粉，轻轻摇匀，使MTT 粉充分溶解，予用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中临时保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。 1.4.6 4%多聚甲醛