(新)大豆蛋白的提取与含量测定

蛋白质产物重量 蛋白质产率= ×100% 原料总重量 思考题 1、用丙酮沉淀蛋白时，为何要调PH4.5~5.0？ 2、大豆中哪类蛋白含量最多？
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
Folin酚法测定蛋白质含量
目的要求
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收， 折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应， Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是 一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂 而昂贵的仪器。 Folin 酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏 100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试 剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷 钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨 兰混合物）。
由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液 兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用 Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样 品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个， 只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温 时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的， 灵敏度较高的操作方法。
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试剂和器材
1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测 定范围。 2、试剂： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称 取 0 . 5 g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 8 0 mlH2O 中 ， 再 加 0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到 500ml，冰箱 保存可用一个月。
大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 徐文俊
序言
蛋白质化学实验
蛋白质是一切生物体内重要的组成成份，蛋白质是由 二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子 化合物，溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的 作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。 蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间 构型。在各种物理化学因素影响下，由于副价键的破 裂，使其空间结构遭受不同程度的破坏，蛋白质的物 理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋 白质的变性。
蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点 时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有 正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉 淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定 条件下（如 PH，离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分 子的大小及形状等方面的差异，可以采用电泳，离子交换柱层析 等方法对它们进行分离分析。 许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度，产生可逆或 不可逆沉淀，这些因素（如增加溶液的离子强度，降低溶液的介 电常数，调节溶液的 PH 等）以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来 分离，提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌 握好理论和实践相结合，把学到的理论应用到实验中，本系列实 验安排是从一种生物中提取蛋白质，通过各种物理化学性质使其 得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。
试剂和器材
1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 （4）PH试纸等
操作方法
1、水抽提 将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅 拌 ， 常 温 下 搅 拌 抽 提 1 5 min， 3800r/min 离 心 15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。 取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。 其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少 量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和1 mol/L HCL， 调 PH4.5~5.0，3800r/min，离心 15min，收集沉 淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白 质干粉，称重，计算粗产率。
蛋白质性质与应用技术关系图
肽 氨基酸
疏 水 性 低 层 析 亲 水 性 极性
酸 碱
酶 离子交换层析 电荷 电泳
蛋白质
形 状
分 子 量
离 心
凝 胶 层 析
一、大豆蛋白的提取
目的要求
1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率
实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶 蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂 提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验 主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。
4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠 （ NaWO4· 2H2O）100g，钼酸钠（ NaMoO· 2M2O）25g， 蒸馏水 700ml，85%的磷酸 50ml，浓盐酸 100ml，充分 混合后，小火回流 10 小时，再加硫酸锂（ Li2SO4）150g， 蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量 的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并 中保存，可使用多年。 上述制备的 Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右， 几种操作方案都是把 Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为 应用液，我们是把贮备液于作用前稀释 18 倍，使之浓度为 0.1mol/L 略高。这种稀释 18 倍后的 Folin 试剂乙就是下文称 之为应用液， Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚 酞 为 指 示 剂 ， 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1 mol/L 左 右 的 标 准 NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿 既为终点。如果用 NaOH 去滴定 Folin 乙，终点不太好掌握， 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。