大豆蛋白的提取与含量测定

实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不
同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。 将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各 部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。
•
称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质
的收率。
试剂和器材
1. 1、试剂 2. （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH 3. （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL 4. （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH
试剂和器材
1、材料： • 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可
测定范围。 2、试剂： • （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 • （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 • （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g • NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； • 称 取 0 . 5 g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 8 0 mlH2O 中 ， 再 加
5. 2、器材 6. （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 7. （4）PH试纸等
操作方法
1. 1、水抽提
2.
将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添
加搅拌，常温下搅拌抽提15min， 3800r/min离心
15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取
上清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。
0
PH7.8的buffer（ml）
3.
其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用
滴管少量多次慢慢滴加 （搅拌），用6mol/L和1
mol/L HCL， 调 PH4.5~5.0，3800r/min， 离 心
15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次
，放入表面皿上，60度烘干，得到粉末状蛋白质干
粉，称重，计算粗产率。
1.
蛋白质产物重量
0箱.2保5存gC可u用SO一4；个以月上。两溶液混合定容到500ml，冰
1. 4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨 酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O ）25g， 蒸 馏 水 7 0 0 ml，85% 的 磷 酸 5 0 ml， 浓 盐 酸 100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（ Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾 15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过 滤后呈金黄色，于棕色瓶中保存，可使用多年。
试管号 0 1 2 3 4 5 S
蛋白质标准液（ml） 0 （mg) 0
提取的样品液（ml）
0.2 0.04
0.4 0.08
0.6 0.12
0.8
1.0
0.16 0.2
0.8
PH7.8的buffer（ml）
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0
0.2
） Folin-甲试剂 （ml
1
1
1
1
1
1
1
于室温下不停地振荡10min
2. 蛋白质产率=
×100%
3.
原料总重量
4. Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
二、Folin酚法测定蛋白质含量
1. 目的要求
2.
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法
3.
实验原理
4.
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫
外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、
双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲
1. 由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶 液兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚 法测定蛋白质含量，灵敏度较高。
2. 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果 样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化 钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的 浓度。
3. Folin酚法有不少个别改进的操作方法，但基本原 理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上、保 温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介 绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。
大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 赵建军 曲宁 夏婷 孟繁新
蛋白质性质与应用技术关系图
肽
氨基酸
疏 水 性
纸 层 析
亲 水 性
酸 碱
酶
极性
蛋白质
电荷
分 形子 状量
离子交换层析 电泳
离 心
凝 胶 层
析
目的要求
•一、1大、掌豆握蛋大豆白蛋白的的提提取取原理和方法
•
2 、计算粗提产率
•
2、学习计算蛋白质收率
Folin-乙应用液（ml） 4
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Βιβλιοθήκη Baidu
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立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650
A650值
？ 0 0.184 0.317 0.425 0.536 0.668
1. 2、样品测定：取三支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml
和空白 ，如下操作：
试管号
空白
1
2
蛋白质稀释液（ml） （mg)
法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便
，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，
比双缩脲法灵敏100倍。
5.
Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双
缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的
磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈
兰色（钼兰和钨兰混合物）。
2. 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左 右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的 浓度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍， 使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂 乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标 定 ， 一 般 是以 酚 酞 为 指示 剂 ， 用 Folin 试 剂 乙去 滴 定 1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫 灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定 Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为 浅绿色，再变为灰紫色为终点。
3、器材：
1. 试管10支 2. 试管架一个 3. 移液管：（5ml、1ml） 4. 移液管架 5. 洗瓶 6. 恒温水浴 7. 723型分光光度计
Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：
取6支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 K=0.308 B=--0.009 R*R=0.9909