发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应条件的建立与优化
微生物发酵工程中的生物过程优化研究
微生物发酵工程中的生物过程优化研究摘要：微生物发酵工程一直是生物技术领域中备受瞩目的研究方向之一。
随着科学技术的不断发展，人们对微生物发酵过程进行了深入的研究，以提高产物质量、产量和可持续性。
本论文旨在探讨微生物发酵工程中的生物过程优化研究，着重介绍优化方法、相关技术和其在不同应用领域的应用。
通过生物过程优化，可以提高发酵工程的效率，降低成本，减少环境影响，并为新药物、生物燃料、食品工业等领域的发展提供支持。
关键词：微生物发酵；生物优化；研究引言微生物发酵是一种生物技术领域的重要过程，涉及微生物生长、代谢产物的生产和回收等方面。
随着对新型产物需求的增加，以及对可持续生产的重视，微生物发酵工程的研究变得更加重要。
为了实现高效的发酵生产，研究人员一直在寻求不断改进和优化微生物发酵过程的方法。
本文将介绍微生物发酵工程中的生物过程优化的关键方面，包括方法、技术和应用领域。
一、生物过程优化方法微生物发酵工程中的生物过程优化通常包括以下方法：发酵条件优化：包括温度、pH值、氧气供应等参数的调整，以提高微生物生长和代谢产物生产的效率。
这需要细致的实验设计和数据分析。
代谢工程：通过改变微生物的遗传信息，如基因工程和重组DNA技术，来增强目标产物的生产能力。
培养基优化：确定最适合特定微生物的培养基成分，以获得更高的产量和更高的产物质量。
监测和控制系统：使用高级传感器和自动化控制系统，对微生物发酵过程进行实时监测和调整。
二、生物过程优化的关键技术微生物发酵工程的生物过程优化离不开一些关键技术的支持，这些技术包括：基因组学和蛋白质组学：通过对微生物基因组和蛋白质组的研究，可以更好地了解微生物的代谢途径和生长机制，为代谢工程提供更多信息。
生物传感器：生物传感器能够实时监测微生物发酵过程中的关键参数，如氧气浓度、酸碱度等，以便进行及时的调整。
计算模拟：借助计算模拟和数值模型，可以更好地预测微生物发酵过程的表现，并进行虚拟实验以寻找最佳条件。
[整理]16s_rdna菌种鉴定
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16S rDNA方法鉴定细菌种属一．目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA普遍存在于原核生物中。
rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2、在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
16s扩增子测序流程
16s扩增子测序流程引言：16s扩增子测序是一种常用的微生物学研究方法，通过对16s rRNA 基因进行扩增和测序，可以获取微生物群落的组成信息。
本文将详细介绍16s扩增子测序的流程，包括样品收集、DNA提取、扩增子设计、PCR扩增、测序和数据分析等环节。
一、样品收集：在进行16s扩增子测序之前，需要准备好待测样品。
样品可以来自环境样品、动物体内、人体内等各种来源。
在收集样品时，需要注意避免污染和样品损伤，保证样品的质量和完整性。
二、DNA提取：样品收集后，需要提取样品中的总DNA。
DNA提取的方法有很多种，常用的有CTAB法、酚/氯仿法、商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA应具有高纯度和高浓度，以保证后续的PCR扩增和测序的质量。
三、扩增子设计：扩增子是指用于扩增16s rRNA基因的引物。
根据不同的研究目的和物种组成，可以设计不同的扩增子。
常用的扩增子包括V1-V9区域的引物。
在设计扩增子时，需要考虑引物的特异性和覆盖范围，以确保扩增到目标基因片段。
四、PCR扩增：PCR扩增是16s扩增子测序的关键步骤。
在PCR扩增中，需要将样品中的16s rRNA基因片段扩增到目标长度。
PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等。
PCR扩增的条件包括温度、时间和循环数等，需要根据具体的扩增子设计和样品特点进行优化。
五、测序：PCR扩增后的产物需要进行测序。
测序技术有很多种，包括传统的Sanger测序和高通量测序技术。
根据实验室条件和研究目的，选择合适的测序平台和方法进行测序。
测序的结果将得到样品中16s rRNA基因片段的序列信息。
六、数据分析：测序后的数据需要进行生物信息学分析。
首先，对测序得到的序列进行质量控制和去噪处理，去除低质量和低复杂度的序列。
然后，将序列比对到参考数据库（如Greengenes、SILVA等），进行分类学注释和物种分析。
最后，可以使用多样性分析方法（如Alpha多样性和Beta多样性分析）对微生物群落进行描述和比较。
发酵过程中的微生物菌种筛选与优化研究
发酵过程中的微生物菌种筛选与优化研究发酵过程中的微生物菌种筛选与优化研究发酵是一种利用微生物进行生物转化的过程，广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。
选择合适的微生物菌种并对其进行筛选与优化是实现高效发酵的关键。
本文将从菌种筛选与优化的原理、方法和应用进行探讨。
首先，菌种筛选与优化的原理是基于微生物生理特征与发酵产物的关系，通过评估菌种的生长速度、产气量、产酸量等生物学特性，确定最适合的菌种。
此外，还需要考虑菌种的耐受性、抗污染能力、代谢途径等方面的特性，以确保菌种在发酵过程中能够稳定、高效地生长。
菌种筛选与优化的方法多样，根据发酵产物的要求和实验条件的不同，可以选择不同的方法来进行研究。
其中，传统的菌落筛选法是通过培养大量微生物菌种，并鉴定其在特定环境下的生理特征，然后根据需求选择合适的菌种。
近年来，高通量筛选技术的发展使得菌种筛选与优化的速度和效率大大提高。
例如，利用基因工程技术构建菌种库，并利用自动化设备进行大规模筛选，可以快速筛选出具有特定功能的菌种。
除了筛选合适的菌种外，菌种优化也是提高发酵效果的重要手段。
菌种优化主要包括两个方面：一是对菌种的基因组进行改造以增加产物的得率和选择性；二是通过调控发酵条件来改善菌种的生长环境，增加产物产量。
菌种基因改造的方法主要包括基因突变、基因敲除和基因工程等手段。
例如，通过敲除抑制产物生成的基因，或是通过引入外源基因来增加产物的合成酶活性，从而提高产物的得率和选择性。
菌种发酵条件的优化包括温度、pH、营养物质和氧气供应等因素的调控。
通过适当的调节这些因素，可以提高菌种的生长速度和产物产量。
菌种筛选与优化研究在食品、医药、化工等众多领域中都有广泛应用。
例如，利用菌种筛选与优化技术可以获得高产酶菌种，用于食品加工中的酶法制备；通过菌种筛选与优化可以获得高效发酵产物的微生物菌种，用于合成生物柴油等领域；菌种筛选与优化也可用于医药领域的抗生素发酵以及活性代谢产物的生产。
微生物发酵过程的优化与调控
微生物发酵过程的优化与调控微生物发酵是一种利用微生物代谢产物来生产食品、药物和化妆品等的生物工艺过程。
在微生物发酵过程中，微生物通过转化底物产生有用的化合物，并且这个过程可以通过一系列的优化和调控来提高产量和品质。
本文将讨论微生物发酵过程的优化与调控方法，以及其在不同领域中的应用情况。
首先，优化微生物发酵过程的关键是选择合适的微生物菌株和培养基。
不同的微生物菌株对底物的利用能力和产物的产量有很大的差异，因此在发酵过程中选择合适的菌株对于优化产量至关重要。
同时，培养基的成分和浓度也会影响微生物的生长和代谢，因此合理调配培养基的组成也是优化发酵过程的关键一环。
其次，控制发酵条件是提高产量和品质的重要手段。
温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等因素都会对微生物的生长和代谢产生影响。
通过合理地控制这些条件，可以调控微生物的代谢途径，提高产物的产量和纯度。
例如，在酒精发酵中，合理控制发酵温度可以提高酵母菌的活性和产酒能力。
此外，基因工程技术在微生物发酵过程中的应用也是一个热门领域。
通过改变菌株的基因组和代谢途径，可以使微生物具备产生特定产物的能力。
例如，基因工程菌株的产生使得人胰岛素的大规模生产成为可能。
通过基因工程技术，微生物可以被赋予新的代谢路径或增强已有代谢途径，从而达到优化发酵过程、提高产物产量和改善产物质量的目的。
在食品工业中，微生物发酵广泛应用于乳制品、酱油、醋和调味品等的生产中。
优化发酵过程可以提高乳酸菌、酵母菌和酸奶菌等微生物的生长和活性，提高产品的营养价值和风味。
同时，微生物发酵还可以产生食品添加剂，如谷氨酸钠、抗生素和硝化酶等，为食品提供特殊的功能和品质。
在药物领域，微生物发酵被广泛应用于抗生素、激素和酶制剂等药物的生产。
优化发酵过程可以提高抗生素的产量和纯度，同时减少副产物的生成，从而降低生产成本。
此外，微生物发酵还可以用于生产重组蛋白药物，如重组胰岛素和重组生长激素等。
通过基因工程技术，微生物可以被改造成为高效产生重组蛋白的工厂。
土壤微生物总DNA提取及其PCR优化
土壤微生物总DNA提取及其PCR优化土壤中的微生物是土壤生态系统中非常重要的组成部分，对于土壤的生物地球化学循环和植物生长起着至关重要的作用。
因此，了解土壤中的微生物群落结构和功能对于研究土壤生态系统和提高农田肥力具有重要意义。
土壤微生物群落分析通常需要进行土壤微生物总DNA的提取，并利用PCR技术对其进行检测和分析。
本文章将介绍土壤微生物总DNA提取的步骤，并对PCR反应进行优化。
1.土壤样品采集：将土壤样品收集到干净的塑料袋中，并尽快将其带回实验室进行处理。
2.土壤样品处理：将土壤样品通过筛网过滤，去除大颗粒物质。
然后，将土壤样品进行均匀混合，以保证提取的土壤微生物样品的代表性。
可以根据具体的研究目的和需求，选择不同的土壤样品处理方法，例如：酶处理、分离培养等。
3.DNA提取：根据所选用的DNA提取试剂盒的说明书，按照其提取方案进行操作。
一般而言，土壤微生物总DNA提取的步骤包括：细胞破碎、蛋白质沉淀、DNA溶解和纯化等步骤。
4. DNA质量检测：提取的土壤微生物总DNA可以通过紫外分光光度计或凝胶电泳等方法进行检测。
常用的DNA浓度检测方法为：通过分光光度计检测DNA的吸光度260 nm/280 nm比值，一般DNA的260 nm/280 nm比值在1.7-1.9之间为纯净的DNA样品。
PCR是一种被广泛应用于土壤微生物群落分析的技术，可以检测和分析微生物群落结构和功能。
下面是PCR反应优化的几个关键步骤：1.引物设计：选择适当的引物对于PCR反应的成功至关重要，引物应能够特异性地扩增所需的目标基因片段。
引物的设计可以根据所研究的微生物基因组序列进行，也可以利用已有的引物库进行。
2.酶和缓冲液优化：PCR反应中酶的选择和相应的缓冲液对于PCR反应的效果有着重要的影响。
可尝试不同品牌和类型的聚合酶和缓冲液，根据实验结果选择最适合的组合。
3.PCR温度参数优化：PCR反应的温度参数也会对PCR反应的效果产生重要影响。
微生物发酵的优化生产
微生物发酵的优化生产微生物发酵代谢与调控主要是通过改变微生物的代谢途径和代谢流量，以实现目标产物的优化生产。
以下是一些常见的微生物发酵代谢与调控的方法：1.营养物质浓度调控：通过调整培养基中营养物质的浓度，可以影响微生物的代谢途径和代谢流量。
例如，增加氮源的浓度可以促进微生物的生长和蛋白质的合成，而减少氮源的浓度可以促进微生物的脂肪合成。
2.温度调控：温度可以影响微生物的代谢速率和细胞生长。
在一定的温度范围内，升高温度可以促进微生物的代谢速率和细胞生长，但过高的温度会导致细胞死亡。
因此，根据不同的微生物种类和目标产物，需要选择适宜的温度进行发酵。
3.pH值调控：pH值可以影响微生物的代谢途径和代谢流量。
例如，酸性条件可以促进微生物的糖酵解代谢途径，而碱性条件可以促进微生物的脂肪合成代谢途径。
因此，通过调整培养基的pH值，可以实现对微生物代谢的精细调控。
4.氧气浓度调控：对于好氧微生物，氧气是必需的，但过高的氧气浓度会抑制微生物的生长和代谢。
因此，在发酵过程中需要控制氧气的供应量，以实现微生物的最佳生长和代谢。
5.添加酶或小分子调控：通过添加酶或小分子化合物，可以实现对微生物代谢的人工调控。
例如，添加特定的酶可以促进或抑制某种代谢途径，从而改变微生物的代谢流量和产物。
6.基因调控：通过基因工程技术，可以改变微生物的基因表达，从而改变其代谢途径和产物。
例如，可以通过敲除或过表达某些基因来抑制或增强某种代谢途径，从而实现目标产物的优化生产。
总之，微生物发酵代谢与调控是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素。
通过精细调控微生物的代谢途径和代谢流量，可以实现目标产物的优化生产。
微生物发酵工艺的优化
2.1 发酵培养基碳、氮源的选择碳源是主要的能量来源，主要在环境中为微生物在培育过程中提供能量。
目前较为常用的碳源应是己糖，主要作为微生物细胞成分和代谢的产物。
在工业规模性培育繁殖中，原料的成本及易用性是着重需要考虑的因素之一。
在发酵过程中较为常用的碳源有淀粉、蔗糖、米糠纤维等。
在微生物发酵中，碳源固然重要，但氮源同样是微生物发酵培养中必不可少的物质。
氮源主要用于微生物细胞材料和含氮的代谢产物，氮源通常分为两类，一类是延迟氮源，而另一类属于速效氮源。
延迟氮源通常包括肽和氨基酸，其主要作用机理是促进细菌生长，在代谢物的形成中同样具有促进作用[2]。
而速效氮源通常包括酵母浸膏、蛋白胨等，能够满足细菌发酵和产品合成时对氮源的需求。
在整个微生物的发酵培育过程中，通过延迟氮源与速效氮源的合理搭配，形成的负荷氮源既能满足节杆菌属细菌的生长，同时还能促进病原拮抗剂的抑制，达到良好的发酵效果。
2.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响磷、硫、钠、锌、锰等无机盐对微生物的生长和代谢产物的产生有一定的影响，磷是微生物生长和代谢活动的重要组成部分，参与磷脂、核酸和多种辅酶的合成，在代谢调节中发挥重要作用。
如成分失衡和高渗压升高，这将部分导致微生物的生长。
微生物发酵和发酵离子交换介质。
2.3 发酵培养基中其他成分对发酵的影响在发酵过程中，发酵培养基还需要其他能积极促进微生物发酵的成分，这大大提高了培养基对微生物发酵的影响，为其产品的形成提供了必要的营养。
其物理性质必须适应微生物发酵。
在选择原材料时，还应考虑价格，在保证质量的基础上选择低成本的原材料。
原料来源必须满足微生物发酵工程长期发展的需要。
0 引言近年来，微生物发酵工程技术得到了广泛的应用。
利用有益微生物和收集相关细菌或代谢物来提高产量和预防疾病的研究越来越多。
不同的微生物和发酵条件有利于发酵产物的生产。
国内外对发酵过程的优化主要集中在碳源、氮源、微量元素、发酵温度、pH 值、发酵时间等发酵条件上。
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收稿日期：2014-04-24基金项目：湖南省农业产业技术体系“湖南省生猪产业技术体系生猪产业规模养殖与环境控制岗位”作者简介：杜东霞（1981—），女，硕士，助理研究员，主要从事环境微生物学及分子生物学研究。
E-mail:xiaxia414@*通信作者：贺月林E-mail:yyqhmm@农业资源与环境学报2014年10月·第31卷·第5期：470-475October 2014·Vol.31·No.5：470-475Journal of Agricultural Resources and Environment随着规模化养猪产业的迅速发展，养殖场造成的环境污染问题显得日益突出。
而发酵床养殖技术是依据自然生态理念和微生态原理，集畜禽粪尿无害化处理与科学饲养于一体的新型环保养猪技术[1]。
该养殖技术是以猪舍内铺设谷壳、米糠、锯末等原料组成的基质垫料作为培养基，人为接种一些环境益生菌,猪饲养过程中所排放的粪尿在猪舍内经微生物原地发酵迅速降解、消化，从而达到零污染、零排放，从源头实现环保、无公害的养殖目的[2]。
发酵床养殖技术的精髓是微生物的发酵和代谢作用，起主要作用的微生物群落结构十分复杂，除了发酵床垫料中的土著微生物外，还包含人为添加的一些功能微生物菌群，在饲养环境下，微生物在相互作用过程中，其群落结构和数量此消彼长，处于不断变化过程中，最终会产生一些优势菌群，主导着畜禽粪便的无害化过程[1，3]。
因此，有必要弄清楚成分复杂的发酵床垫料中微生物的种类、数量、亲缘关系以及群落的演替规律，有助于开发出新型、高效、安全、稳定的微生物菌剂，促进发酵床养猪技术的进一步发展。
然而，近几年来，发酵床垫料中的微生物群落动态及分子生态学的研究显得十分的薄弱，一方面是由于许多功能微生物无法在实验室培养，传统的微生物纯培发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应条件的建立与优化杜东霞，尹红梅，张德元，刘标，许隽，王震，贺月林*（湖南省微生物研究院，湖南长沙410009）摘要：为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA 基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响，采用单因素法对16S rDNA 基因扩增时PCR 反应体系中的5个潜在因素（Mg 2+、dNTP 、引物、Taq 酶、模板DNA ）5水平上进行优化实验，并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。
结果表明：25μL 的最佳反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL 、MgCl 22.0mmol ·L -1、dNTP 0.2mmol ·L -1、引物0.2μmol ·L -1、Taq DNA 聚合酶0.5U 、模板DNA 50ng ；最佳反应程序为：在94℃下进行4min 预变性；随后循环扩增25个循环（包括94℃变性45s ，53.7℃退火30s ，72℃延伸90s ）；最后在72℃下延伸10min 。
关键词：发酵床垫料；16S rDNA ；单因素法；退火温度中图分类号：Q93-331文献标志码：A 文章编号：2095-6819（2014）05-0470-06doi:10.13254/j.jare.2014.0102Establishment and Optimization of Microbial 16S rDNA PCR Reaction Conditions in Fermentation Bed Padding MaterialDU Dong-xia,YIN Hong-mei,ZHANG De-yuan,LIU Biao,XU Jun,WANG Zhen,HE Yue-lin *（Hunan Academy of Microbiology,Changsha 410009,China ）Abstract:In order to study the influence of several potential factors on 16S rDNA PCR reaction conditions in fermentation bed padding mate -rial,five factors （Mg 2+,dNTP,primer,Taq DNA polymerase and DNA template ）were optimized by single factor experiment at 5concentrationlevels.Annealing temperatures and amplification cycle numbers were also optimized.The results showed that the optimum 25μL reaction system comprised 10×PCR buffer 25μL,MgCl 22.0mmol ·L -1,dNTP 0.2mmol ·L -1,primer 0.2μmol ·L -1,Taq DNA polymerase 0.5U and DNA template 50ng;and the optimum PCR procedure was as an initial pre-denaturing at 94℃for 4min,which preceded 25cycles of dena -turing at 94℃for 45s,annealing at 53.7℃for 30s,and extension at 72℃for 90s,with a final extension at 72℃for 10min.Keywords:fermentation bed padding material;16S rDNA;single factor experiment;annealing temperature2014年10月养无法反映发酵床垫料中微生物的丰度；另一方面用分离微生物的方法研究微生物群落动态变化规律工作十分繁重，而且对了解微生物实际群落变化比较困难[2]。
近年来，随着现代生物技术和微生物分子生物学的迅速发展，基于DNA分析的分子生态技术为解决该难题提供了强有力的工具。
通过菌群的DNA分析可以比较全面地了解发酵床垫料中微生物群落的结构变化，极大地促进发酵床垫料中微生物多样性的研究。
它既可以绕开传统分离方法复杂和繁琐的操作，又可以鉴定纯培养方法难以鉴定的菌种[4-5]。
但该方法的应用必须以获得能真实反映原环境样品中微生物实际组成状况的总DNA及高质量的PCR产物为基础，鉴于此，本文对发酵床垫料中微生物总DNA的提取方法进行了探索，同时建立与优化了微生物16S rDNAPCR反应条件，为揭示发酵床垫料中微生物群落的动态变化规律及研制高效专一的发酵床复合菌剂奠定理论基础。
1材料与方法1.1实验材料1.1.1发酵床垫料来源于唐人神养殖场，在发酵床垫料30cm处“Z”字形5点取样，混合均匀后作为实验样本，塑料袋密封低温保存。
1.1.2主要试剂和设备土壤总DNA提取试剂盒（Ultra Clean Soil DNA Iso lation Kit），购于美国MOBIO公司；PCR仪（Mastercy cler pro）购于Eppendorf公司；Cary50紫外可见分光光度计购自美国VARIAN公司；5424R小型台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；DYY-6C型电泳仪购自北京六一仪器厂；Bio-Rad Gel Doc2000型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2实验方法1.2.1发酵床垫料中微生物总DNA提取参照文献[6]的方法并进行了适当修改。
1.2.1.1发酵床垫料样品预处理新鲜垫料经液氮研磨之后，称取5g于30mL离心管中，用TENP缓冲液洗涤，直到上清液清澈透明，离心的沉淀用于DNA提取。
1.2.1.2发酵床垫料中微生物总DNA提取采用以下2种方法对制备的发酵床垫料样品进行微生物总DNA的提取。
（1）SDS-CTAB结合法：①称取2g沉淀置于30 mL洁净离心管中，在沉淀中加入15mL SDS裂解液，200μL蛋白酶K和0.8mL异硫氰酸胍洗液，轻轻颠转混匀，65℃温育1h；②6000r·min-1离心10min，转移上清液至30mL洁净离心管；③加入0.2倍体积的醋酸钠溶液和1.7倍体积的10%PEG8000溶液，-20℃下静置15min；④10000r·min-1，4℃，离心10min，留沉淀；⑤往沉淀中加入15mL CTAB裂解液，65℃温育15min；⑥加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），轻轻混匀，10000r·min-1离心10min；⑦将上清液转移到新的30mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，置于4℃过夜；⑧12000r·min-1，4℃，离心10min，弃上清液，留沉淀。
用1mL70%乙醇洗涤沉淀，转移到1.5mL离心管中。
14000r·min-1，4℃，离心3min，弃上清液，留沉淀。
再重复洗涤1次，超净台吹干，之后加入300μL无菌水溶解DNA，-20℃保存备用。
（2）土壤总DNA提取试剂盒法：该实验步骤严格参照说明书进行操作。
1.2.2DNA浓度和纯度的测定方法用紫外分光光度法分别测定不同方法提取的DNA溶液在不同波长处的吸光度（OD260、OD230、OD280），根据公式：[dsDNA]=50×OD260×稀释倍数，计算DNA的浓度（单位为μg·mL-1）,分别用OD260/OD230、OD260/OD280估算所提取DNA的纯度。
1.2.3发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应体系的建立引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）扩增细菌16S rDNA；PCR扩增体系：10×PCR buffer2.5μL，dNTPs2μL，上下游引物（10μmol·L-1）各1μL，DNA模板稀释液1μL，Taq DNA聚合酶（5U·μL-1）0.2μL，其余用无菌水补齐至25μL；PCR反应条件：94℃预变性4min，（94℃变性45 s，53℃退火30s，72℃延伸90s）30个循环，最后72℃延伸10min。
1.2.4发酵床垫料中微生物16S rDNA的PCR反应条件优化退火温度的选择：对扩增程序中最为关键的退火温度进行优化，分别设置为：48.3、50.0、51.8、53.7、55.5℃。