NRC2011版2-基本概念与方法

2基本概念及方法 水生动物营养是一门相对较新的科学。虽然它和陆生动物营养有很多相似处，但是水生动物营养研究者要面临大量的在陆生动物研究中不曾遇到的挑战。这些挑战主要来源于水环境，在水环境中需要特别考虑营养输送、观察摄食、废弃物的收集和定量，以及不同种类鱼虾的特定生理特征。试验动物的数量以及试验日粮的原料与营养组成都将进一步影响到准确数据的收集，干扰实际应用效果。 一定程度上，水生动物营养就是要持续定义试验方案，借鉴陆生动物的一些概念和方法，获得结果并以先前的研究结果为基础，严格审查试验结果的科学性及正确性。本章为鱼虾及甲壳类动物获得可靠的实验结果推荐了一些研究方法，为试验设计及数据分析提供了一些指导建议。采用合适的试验方案及正确的数据统计分析估计营养需求将有利于鱼虾营养学的发展。

营养需求量的确定 在试验设计前，谨慎的设定试验的目的十分重要。试验设计需要考虑多方面的因素，主要有种类、养殖系统、配方设计、样本及数据收集、指标测定和数据分析。试验设计必须建立在明确、简洁和可检验的假设之上。 鱼虾营养需要量测定过程，需要采用常规试验方法进行假设检验。采用常规试验方法获得的试验结果可以与已报道的结果相比较。虽然所有的试验程序不能通用于所有的种类或者某一种类的不同生长阶段，但是有必要为试验设计、养殖试验过程以及数据的分析建立基本的试验指导方针。因此，本章主要是提供一些建议，以便控制一些影响我们营养研究结果的误差及误差的来源。这些建议为更好地衡量和评价鱼虾营养需求研究方法奠定了基础。

试验设计及条件 试验研究的目的是对试验处理效果下一结论。因此，试验设计要减少试验性错误造成的误差，使各处理组间存在的差异表现出来。虽然鱼类营养试验设计的基本原则与陆生动物（猪、牛、禽类）类似，但是水生动物的营养试验有其特殊性。水生动物生存的水环境为其研究带来了很多困难：如限制了对养殖动物的观察，未被摄食的饲料及营养素溶失对结果的负作用，水环境本身还可以提供溶解性矿物质和浮游生物。因此，需要特别注意试验中的养殖系统和水源，以确保整个试验过程中有良好的水质环境。养殖过程中随着养殖动物的生长和采食率的上升，保证良好的水质环境将变得异常严峻和重要。控制养殖密度（数量和质量）在一个合适水平，将可以有效避免养殖动物的“密度依靠性生长”或“等级优势”等问题。 与禽类和小鼠（很多营养研究中的实验动物）相比，鱼虾由于遗传多样性，在营养试验中的特征和反应存在更宽的差异。这种同物种内的差异主要由遗传和环境造成。水生动物在相对较长时间内缺少驯养，是其与家畜或实验动物（鼠）之间最主要的区别。

试验养殖系统 养殖系统的设计是营养试验中提高试验结果可靠性的一个重要的因素。养殖系统设计的最终目标，是使养殖动物通过有效的饲料利用，发挥并达到其生长潜能。 营养试验中使用的养殖系统主要有：流水式、循环式、半循环式以及静水式。每一种系统都有缺点，但是选择一种养殖系统的目的，是为试验动物提供适宜的生长环境，利于其正常生长。使用没有连续水流的养殖系统时要求严格管理水质，以避免代谢物的积累而降低动物的生长及影响其他性能指标。因此，静水养殖需要有规律的换水，它可以一定程度上中断对养殖动物生长性能的负影响。循环养殖系统需要生物物理过滤系统，来阻止影响鱼类生长的代谢产物和微粒（间接细菌量的增加）的积累。流水养殖系统也需要控制水质条件，使其不受时间和空间的影响。 理想的养殖系统需要将各重复处理间相互隔离，也就是说，一个处理组的水不能流入其他处理组。这种设计可有效地避免一个试验组的代谢产物在水的流动过程中转移和积累，而影响其他处理组。虽然这些代谢产物可能是短暂性的，但是小的积累仍会影响水中生物的生长。因此，在营养试验中要禁止使用串行方式输送水的养殖系统。 每个试验组（如一缸鱼即为一个重复）的养殖容积十分重要，每一个处理组都必须要有足够大的容积，以避免是容积成为限制因素而不是营养水平差异造成的结果的出现。D’Abramo 等在对幼虾(Macrobrachium rosenbergii)研究时发生过这种情况。因此，养殖系统的容积设定应建立在预期的最终生物体的密度（生物量）之上。足够的养殖容积以及适当的水流速度将会消除养殖容器对试验的误差。 单个试验系统，不管是水槽、容器还是玻璃缸，都是是方便观察、数据分析的代表单元。进行方差分析或者其他数据分析时，前提假设都是每一个处理组都是相互独立的，包括水源。分配到每个养殖单位内的生物数量，主要取决于所研究的动物种类。每个处理组内实验动物的数量，一定要远小于能产生等级摄食行为和发生不平等性别比例的数量。如果每个处理组内试验动物数量不止一个，应以处理组的整体参数用于数据分析。在某些情况下，如果处理组内的试验动物可明显区别的，它们的个体参数也可以作为评价指标。如果是两个处理组相比较，简单的t检验是首选的数据检验方法。如果每个处理组内的每个试验动物在整个试验过程中不同时间段的重量（包括初始体重和末体重）都有记录，那么就可以计算出生长率指数。以每个动物在不同时间段内的体重的对数做直线回归图，其斜率就是生长率指数。然后将每一处理组的生长率指数作方差分析来确定各处理组间是否有显著差异。然而，反复称量试验动物将产生应激导致死亡。

试验对象 鱼虾的来源、品系、生长阶段、以往营养史和环境都将影响营养试验的结果。所研究的鱼虾的来源和遗传背景需要被了解和报道，否则后续将无法操作试验差异的比较，因为遗传背景影响动物的生长。获得试验动物充足的生长率，对比较营养物质间的差异非常必要。了解试验动物的年龄，可以避免一些由年龄引起的生长差异导致的不令人满意的结果。 根据试验目的，使用来自同一亲本或者几个亲本的试验对象有助于减小系统误差。如果试验对象由多个卵子发育形成，按一定比列将其分配到各个处理组中，可以减少由不同亲本造成的系统误差。

试验日粮 为了确定营养需求量，我们需要设计几个特定营养素在营养水平和组成上有变化（上升、下降或者缺乏）的日粮。研究人员通常采用由特定原料或化学物组成的基础日粮，即半纯化的日粮，这种日粮可以很好的控制试验日粮的营养组成（尤其是所研究的营养素）。然而，对于很多动物来说，当饲用纯和日粮时，其饲料利用率和生长都显著低于其最适水平。因此，可以采用由已知营养组份和被证明有助于目标鱼类的维持正常增重率的原料配制而成的日粮，来评估鱼类最终能达到的生长潜力。基础日粮可由应用日粮原料(如，小麦和鱼粉)或者半纯化日粮原料(如，淀粉和酪蛋白)配制而成。另外，一些实际日粮原料因某种营养素含量较高，会促使它在营养需求试验研究中的使用。使用实际原料时应确保除了所研究的营养素之外的所有其他营养素应维持在同一营养水平上。通过严格控制实际原料成分的质量和数量，可以确定所要研究的营养素的合适的水平范围。对一些种类来说，活饵日粮可以作为参考，它为试验动物和养殖系统在试验中的充分表现提供了重要的基础信息。该参考日粮可以在数据分析中与其他试验日粮进行比较。但是，来源于参考日粮的数据不能用于采用化合物组成的日粮评定营养需求量的试验中。 无论是使用半纯化日粮还是实际日粮，为了确保所需的物理特性得到控制，必须做充分的日粮准备。饲料中的原料必须来源一致。混合完全后，所有原料必须粉碎到统一粒径，接着再次混合确保其均匀性。饲料制粒成型后应尽快被试验动物饲用耗尽，尽可能地避免由于温度过高降低营养素（尤其是所研究的营养素）的生物利用率。在试验过程中应低温保存（通常冷冻）饲料以确保其新鲜性（营养完整）。少量的饲料在饲喂前可储存在4℃环境下。 养殖试验开始前，必须检测日粮以确定所研究的实际营养水平是否和理论值一致。养殖试验的结果必须以日粮中的实际营养水平为基础进行分析。如果没有检测日粮营养水平，可能导致错误的结果出现。 准确确定营养需求量需要足够多的包含营养素不同水平的处理组，并且日粮中其他营养素能够满足试验动物的需求量。不添加目标营养素的基础日粮为反应变量的估计提供了基础水平。其他试验日粮应包含从缺乏到超过其预期需求量的所有营养水平。 营养需求量的试验设计通常先以较大范围的间隔水平来初步预测反应。再通过试验结果选择适当小的范围来精确估计需求量。一般来说，在选定范围内应该设定至少五个营养水平。

饲养管理和试验周期 试验动物通常需要饱食投喂来确保其最大生长，以便各组饲料之间如果存在差异的话，就使其能表现出来。可通过合适次数的饱食投喂和提供略微大于试验动物在特定生长时期所消耗的饲料量，来达到其最大生长。提高饲料利用率，主要侧重于减少未吃食饲料量、回收未食饲料和减去未食饲料量。投喂频率是试验设计中一个重要的考虑因素，不同种类和不同生长阶段应采用不同的投喂频率。对幼年快速生长阶段的动物每天投喂数次并逐渐调整，将有助于其生长。 当试验饲料改变时，很多鱼类在短时间内会降低饲料摄入量。在进行试验前，应使用饲料驯化鱼虾一段时间，使其适应养殖环境及饲料。一般情况下，驯化饲料的营养成分和组成应与试验饲料相接近。这样就可确保每个处理组的试验动物在试验开始时都处于同样的营养状态。 幼年阶段动物的生长速度快于成年动物，因此其对营养物质不同水平的反应更灵敏。当选择增重率作为评价指标时，应着重考虑试验结束时其值能否达到足够高的水平来反应各处理组间的差异。对于生长速度快的动物，其增重率应高于1000%（初始体重的10 倍）；但是对于较大的鱼类以及虾，增重率达到200%-300%便可接受，通常以增重率达到300%（比初始体重大两倍）为标准。前面提到的增重率只是参考，由于试验目的和试验动物生长阶段的不同其实际增重率会偏低。试验周期由水温和营养素的反应时间决定。当各处理组间出现差异，可提前结束试验。但是，如果提前结束试验，各营养水平间的潜在的重要差异反应就可能无法观察到。 有人建议养殖周期应为8-12周，但是随意指定一个特定的时间周期是不合适的(Cowey, 1992)。如果进行剂量效应试验，较大的增重率可以作为重要的剂量效应关系的评价指标。增重率是最常见的评价指标，但是不一定是最合适的(Baker, 1986)。

试验设计的重复性 需求量的判定通常以回归试验设计为基础。各处理组内重复的数量，由试验动物反应的差异所决定。试验中鱼虾的反应，是由处理组和实验生物差异共同作用的结果。各处理组间的差异，应高于由各重复间养殖系统造成的实验生物差异。当试验重复不多且有较大的系统误差时，将会导致处理组间的显著差异无法产生。试验处理的重复数量由试验设计、种类、鱼虾的品系和试验目的所决定。有力的数据分析可以决定重复数量，从而使统计结果更准确和可靠（Bausell and Li,2002）。