细胞冻存的操作步骤
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞冻存液使用方法
细胞冻存液使用方法介绍如下：
1.准备工作：
o确保工作区域和操作器具的清洁与无菌。
o准备细胞冻存液，根据制备的配方和方法准备好冻存液。
2.细胞冷冻：
o从培养皿中取出细胞，并尽快将培养基抽去。
o加入适量的细胞冻存液，轻轻悬浮细胞，确保均匀混合。
o将细胞冻存液转移至冻存管中，注意不要产生气泡。
o封闭冻存管，确保密封。
3.冻存过程：
o将冻存管放置在冷冻盒中，并迅速将其放入冰箱冷冻室。
o使用冷冻梯度降温的方法，逐渐降低细胞的温度至-80°C 以下。
4.长期储存：
o将冻存管转移到液氮罐等更低温度的冷冻设备中进行长期储存。
o长期储存时，细胞应该避免暴露在温度变化和湿气中。
5.解冻和复苏：
o从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37°C预热的水浴中进行解冻。
o解冻后，立即将细胞冻存液转移到预先准备好的培养基中。
o轻轻悬浮细胞，将细胞转移到新的培养皿中进行培养。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤细胞冻存和复苏听起来像是高深的科学术语，其实说白了，就像把细胞装进冰箱里暂时“冷藏”，然后再拿出来“解冻”一样。
这样做的目的，是为了保存细胞的活性和功能，方便未来的研究或治疗。
那具体怎么操作呢？来，我给你一步步拆解这门科学。
1. 细胞冻存1.1 准备工作首先，你得确保你手头有一切所需的材料。
想象一下，你要出门旅行，得先把行李打包好对吧？冻存细胞也是一样，你需要准备冻存管、冻存液（通常是含有二甲基亚砜（DMSO）的冻存液）、冷冻设备等。
1.2 细胞收集接下来就是收集细胞了。
像是在收集宝贵的珍珠一样，你要小心翼翼地操作。
取出细胞时，要确保培养基是温暖的，细胞在里面像小鱼在水中一样舒适。
把细胞离心后，用吸管轻轻地取出细胞沉淀物，别弄成一团糟。
此时，你的细胞就像小小的珍宝，正准备“打包”进冻存管。
1.3 冻存液准备冻存液的准备很重要。
通常，冻存液里含有二甲基亚砜（DMSO），它能帮助保护细胞免受冷冻过程中冰晶形成的伤害。
用时，一般是按照比例混合好，倒入已经准备好的细胞悬液中，搅拌均匀。
这就像是给你的细胞穿上一件防寒大衣，确保它们在寒冷的“冰箱”里不会感冒。
1.4 冻存过程好了，液体准备好了，接下来就要将细胞放入冻存管中，然后开始冷冻过程了。
细胞冻存管要放进预冷的冰箱里，逐渐降温。
这时候，温度得降得非常缓慢，不能急功近利。
通常，我们会在80°C的冰箱里慢慢降温，直到彻底冻住。
记住，冷冻过程就像等待一锅慢炖汤，急不得。
2. 细胞复苏2.1 取出冻存管当你需要使用冻存的细胞时，首先要把冻存管从冷冻设备里拿出来。
这个步骤就像你从冰箱里拿出刚冷藏好的冰淇淋。
速度要快，不然细胞受热时间过长，可能会损失活性。
拿出来后，立刻放入37°C的水浴中，快速解冻。
2.2 解冻解冻的时候，就像把冰淇淋从冰箱里拿出来放在桌上，过一会儿就开始变得柔软。
细胞的冻存管要在水浴中不断摇晃，确保液体均匀加热。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤细胞的传代冻存技术是生物医学研究中的一个重要方式。
该技术可以将细胞批量保存并长期维持其活性，以便进行进一步的研究。
细胞传代冻存的过程可以简单地概括为以下几个步骤：从培养皿中收集细胞，处理和停滞细胞增殖，添加冻存保护剂，将细胞悬液冷冻存储，最后进行复苏。
下面我们就详细描述一下这个具体步骤：1. 收集细胞收集细胞需要注意细胞的龄期，通常在细胞的对数生长期收集更好。
另外要注意细胞的数量不能过少或过多。
2. 停滞细胞增殖为了将细胞传代，减少增值周期并停滞细胞增殖是必要的。
对于一些高度增殖性的细胞，可以通过干预细胞内基因表达、添加生长因子等方式来实现。
一般可以使用过量的培养基，并将细胞保存在低吸附的容器中来停滞细胞增殖。
这样可以防止细胞形成多层，而保证单层生长。
3. 添加冻存保护剂添加冻存保护剂是细胞传代冻存的关键步骤之一。
冻存保护剂可以有效地保护细胞免受冻结脱水、冰晶形成和低温应力等因素的损害。
最常用的冻存保护剂是一些有机溶剂，例如DMSO（二甲基亚砜）、甘油等。
这些保护剂可以在细胞冷冻存储的过程中降低溶液的结冰点，防止冰晶的形成。
4. 冷冻存储在添加了冻存保护剂后，可以将细胞悬液装入冷冻管中，使用缓慢冷冻和液氮快速冷冻两种方法将细胞冷冻存储；液氮快速冷冻的方式冷冻效率高，但是会对细胞产生更大的应激，可能会降低细胞的复苏率。
缓慢冷冻是比较安全的方式，可以使用-80度的冰箱进行冷冻，时间从数小时到数日不等。
5. 复苏细胞冻存后，想要复苏它们，需要将细胞迅速退回到正常培养条件下。
此时需要谨慎地处理，以免破坏细胞结构和细胞膜等。
复苏的过程需要按照以下步骤：- 缓慢加热：将冻存细胞悬液从液氮中取出，快速将冻存管放入37度的水浴中，缓慢加热，让细胞悬浮在解冻液中的DMSO等有机溶剂逐渐被稀释。
- 洗涤：用无血清的培养基或PBS等洗涤一遍细胞，约10分钟，以去除有机溶剂。
- 均匀吸附：将无血清培养基或PBS加入细胞悬液中，让细胞吸附于培养皿上，约30分钟。
冻存细胞的实验步骤
冻存细胞的实验步骤：
1、从恒温箱里取出装有HL60细胞的培养瓶，拿到超净台里，放在酒精灯火焰上消毒。
之
后，打开盖子，再次在酒精灯火焰上消毒，然后，把培养瓶里的培养液倒入离心管里。
2、离心：去另一支离心管，加入等量的蒸馏水，两个离心管对着放入离心仪里。
把时间指
针调到10.然后，缓慢地将转速指针调到1.
3、吸走上清液，注入冻存液：取出带有细胞的离心管，放在火焰上消毒，用吸管吸走上清
液，加入2mL冻存液、打散。
4、分装：用吸管平均分装到两个冻存管里。
5、冻存细胞：先放在温度适中的冰箱里30分钟，再移入温度较低的冰箱中30分钟，最后，
放到温度为-80度的冰箱中。
6、。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase 长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。
(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。
2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。
3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。
(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。
(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。
4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。
(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。
(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。
5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。
悬浮细胞复苏传代冻存详细步骤
THP1细胞复苏传代以及冻存步骤
一,复苏
1,将液氮中冻存细胞拿出，迅速放在37℃水浴锅1-2min至融化。
2,1640培养液提前放入37℃,用1640培养基6ml左右洗涤一次，注意吹打使细胞分散，然后300g（rcf）5min离心（活细胞最大1400g）3,弃掉上清，用6ml左右培养基重悬。
4,加入到T25培养瓶，镜下观察细胞状态。
5,悬浮细胞竖立放入温箱。
二，传代（传代两次以上再用于后续实验）
1,镜下观察细胞密度，计数板计数，确定稀释倍数。
2,300g（rcf）5min离心，去除培养液。
3,加入适量预热的培养基，制成10^5个细胞/ml 的细胞悬液。
4,分装到2-3个新培养基，将其放入培养箱，24h观察一次（变黄了就传一次，2d左右）
三,冻存细胞
1，离心弃上清，用冻存液（领商品化试剂或者领血清，DMSO等配制），1ml左右混匀，注意避免气泡。
2,商品化的先放进-80℃，4h左右，再放入液氮罐，自己配制的要缓冻，先将-80℃盒子拿出来平衡，然后放入-80℃过夜，然后放液氮，或者在4℃，-20℃，-80℃依次放4h，然后转入液氮。
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细胞冻存的操作步骤
细胞冻存是一种将细胞保存在非常低的温度下，以便长期保存和使用的方法。
它被广泛应用于细胞学、生物医学研究和生物技术领域。
下面将介绍细胞冻存的操作步骤。
1. 准备工作
在进行细胞冻存之前，需要做一些准备工作。
首先，准备好培养基和冻存液。
培养基是细胞生长和繁殖所必需的营养物质，而冻存液则是用于保护细胞在极低温度下的稳定性。
同时，准备好冷冻管、离心机和冷冻盒等实验工具。
2. 细胞培养
将需要冻存的细胞进行培养。
将细胞分散在含有培养基的培养皿中，放入培养箱中进行培养。
培养条件可以根据细胞类型进行调整，一般需要在恒温、恒湿的环境中进行。
3. 细胞准备
当细胞达到适当的生长状态后，可以开始进行细胞冻存的准备工作。
首先，将细胞从培养皿中取出，用无菌缓冲液洗涤，去除培养基和细胞碎片等杂质。
然后，使用显微镜观察细胞的形态，确保细胞的健康和完整。
4. 细胞计数
使用细胞计数仪或显微镜，对细胞进行计数。
细胞计数是为了确定细胞的浓度，以便在后续步骤中制备适当的冻存液。
确保细胞计数的准确性和可重复性，可以重复计数多次并取平均值。
5. 制备冻存液
根据细胞类型和要求，制备适当的冻存液。
冻存液通常包含培养基和添加剂，如凝胶剂、血清和甘油等。
这些添加剂可以提高细胞在冻存过程中的存活率和稳定性。
根据实验要求，可以调整添加剂的浓度和比例。
6. 冻存管标记
在进行细胞冻存之前，需要对冻存管进行标记，以便将来识别和使用。
在冻存管上标记细胞类型、通行日期和样品编号等信息，确保实验记录的完整和准确。
7. 冻存
将冻存液和细胞按照一定比例混合均匀，然后将混合液转移到冻存管中。
注意，冻存管要留出足够的空间，以便细胞冻结时膨胀。
将冻存管放入冷冻盒中，确保冻存管垂直放置，避免液体泄漏。
8. 冷冻
将冷冻盒放入预先冷却好的冷冻盒中，然后将冷冻盒放入-80°C或液氮罐中进行冷冻。
冷冻的速度对细胞的存活率和质量至关重要，应尽量快速冷冻。
在冷冻过程中，细胞会形成冰晶，需要保护细胞
免受冰晶的损伤。
9. 存储
将冷冻的细胞存放在恒温的液氮罐中，通常存放温度为-196°C。
在存储过程中，要确保液氮的供应充足，并定期检查存储条件和液氮罐的密封性，以防止细胞样品的损坏和污染。
10. 解冻
当需要使用冻存的细胞时，可以进行解冻操作。
解冻前，将冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37°C的水浴中。
待冻存液完全融化后，将细胞转移到预先准备好的培养皿中，并进行适当的处理和培养。
细胞冻存是一项重要的技术，它能够长期保存和保护细胞，为科研和应用提供了便利。
通过上述步骤的正确操作，可以确保细胞冻存的成功率和细胞样品的质量，为后续的实验和研究工作提供可靠的细胞资源。