细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。
细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。
细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。
本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。
细胞冻存篇冻存原则细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。
如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。
在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。
DMSO使用注意事项DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。
需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。
另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。
程序冻存液配方程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。
血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。
细胞冻存密度细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。
提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。
冻存操作方法方法一：使用程序冻存盒使用程序降温盒是最常用的冻存方法。
市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。
降温盒须恢复室温后再使用。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。
操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存▲ 使用冻存盒操作示意图方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。
如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。
目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。
细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。
细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。
三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞复苏的原理和方法
细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。
细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。
与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
细胞复苏的方法如下：1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。
在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。
细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。
如果37℃水浴时间延长，会提高细胞死亡率。
2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。
3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。
三天可进行一次换液。
当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。
此外，还有一些注意事项：1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。
如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。
由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。
2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。
4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
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培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论⏹Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。
接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。
１94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。
Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。
而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。
返回页首⏹冷冻保存与复苏原理在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰。
如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。
如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。
这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。
当温度进一步下降,细胞内外都结冰,产生冰晶损伤。
但就是如果在溶液中加入冷冻保护剂,则可保护细胞免受溶质损伤与冰晶损伤。
因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合,从而降低冰点,减少冰晶的形成,并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质损伤,细胞得以在超低温条件下保存。
在复苏时,一般以很快的速度升温,1-2分钟内即恢复到常温,细胞内外不会重新形成较大的冰晶,也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间,从而无冰晶损伤与溶质损伤产生,冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构与功能。
冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度与复温速率有关。
而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
返回页首 冷冻速率冷冻速率就是指降温的速度,直接关系到冷冻效果。
细胞在冷冻过程中会发生如下变化:当细胞被冷至-50Ｃ时,因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点,细胞内外溶液仍未结冰;当被冷至-5~－15０C之间时,细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。
细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。
其结果就是,细胞内水分子为了与细胞外水分子保持化学能的平衡,会向细胞外流动。
冷冻速度不同,细胞内水分向外流动的情况也不相同:如果冷冻速度慢,细胞内水分外渗多,细胞脱水,体积缩小,细胞内溶质浓度增高,细胞内不会发生结冰;如果冷冻速度快,细胞内水分没有足够的时间外渗,结果随着温度的下降而发生细胞内结冰;如果冷冻速度非常快(即超快速冷冻),则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态(玻璃化冷冻)。
Luyeｔ(1973)证实液体的凝固可分为两种形式:一种就是晶体化,溶液中的分子呈有序排列;另一种情况就是非晶体即玻璃化,液体中的分子呈无序状态,保持未凝固前的状态。
不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化,也可以对细胞产生不同的损伤。
当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性。
同时冷冻速度过慢,还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤。
当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会形成较多冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏,产生细胞内冰晶损伤。
超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说就是最为理想的冷冻方法。
细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜与细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。
不同细胞的最适冷冻速率不同。
小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1、6０C/miｎ、70C/mｉn与2000C/mｉn。
细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在１、６0Ｃ～３0０0Ｃ/min,故对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其最适冷冻速率,以保证获得最高的冷冻存活率。
返回页首 冷冻保存温度冷冻保存温度就是指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止,但经过长期保存,在复苏后仍能保持正常的结构与功能。
不同的细胞与生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果,冷冻保存温度可以不同。
但从实际与效益的观点出发,液氮温度(－1９6０Ｃ)就是目前最佳的冷冻保存温度。
在-19６０C时,细胞的生命活动几乎完全停止,但复苏后细胞的结构与功能完好。
如果冷冻过程得当,一般生物样品在-１96０C 下均可保存十年以上。
应用-700Ｃ~－800C保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低。
在冰点到-４00C范围内保存细胞的效果不佳。
返回页首♦复苏速率冷冻保护体外培养物,除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂与冻存温度外,在复苏时也必须有最佳的复温速率,这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。
复温速率就是指在细胞复苏时温度升高的速度。
复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。
一般来说,复温速度越快越好。
常规的做法就是,在３７0Ｃ水浴中,于1-2分钟内完成复苏。
复温速度过慢,细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。
复温时造成的细胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生。
返回页首♦冷冻保护剂冷冻保护剂就是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。
冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。
一般来讲,只有红细胞、大多数微生物与极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中,并以最适的冷冻速率冷冻,可以获得活的冻存物。
但对于大多数有核哺乳动物细胞来说,在不加冷冻保护剂的情况下,无最适冷冻速率可言,也不能获得活的冷冻物。
例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中,并以0、3～６00０C/ｍin的冷冻速率降温冷冻,９８%以上的细胞会死亡;而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时,98％以上的细胞都可存活。
冷冻保护剂可分为渗透性与非渗透性两类。
渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内,一般就是一些小分子物质,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。
其保护机制就是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤,同时,细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩。
甘油与ＤMSＯ并不防止细胞内结冰,在使用该类冷冻保护剂时,需要一定的时间进行预冷,让甘油或DMSＯ等成分渗透到细胞内,在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。
目前DMSO的应用比甘油更为广泛,但要注意的就是,DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大,而在40C时,其毒性作用大大减弱,且仍能以较快的速度渗透到细胞内。
所以,冻存时ＤMSＯ平衡多在40Ｃ下进行,一般需要40~6０分钟。
非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内,一般就是些大分子物质,主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。
其保护机制的假说很多,其中有一种可能就是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合,降低溶液中自由水的含量,使冰点降低,减少冰晶的形成;同时,由于其分子量大,使溶液中电解质浓度降低,从而减轻溶质损伤。
不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。
目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
由于许多冷冻保护剂(如DMSO)在低温下能保护细胞,但在常温下却对细胞有害,故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。
返回页首 冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后就是否形成冰晶来划分,冻存方法可分为非玻璃化与玻璃化冻存两种。
非玻璃化冻存就是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-７00C～-8０0C,然后直接投入液氮进行保存;或者就是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液,按一定的降温速率从室温降至-1０00C以下,再直接投入液氮保存的方法。
以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。
玻璃化冻存则就是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞,直接投入液氮进行冻存的方法。
以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。
但目前细胞冻存最常用的仍就是前一种方法。
返回页首 非玻璃化冻存方法下面以肿瘤细胞与杂交瘤细胞为例,介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。
返回页首✧主要材料(1)仪器设备:普通冰箱、-300C低温冰箱与-７00C～-８00C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等;(2)冻存管:容量为1ml或1、5ml;(3)冷冻保护液:一般就是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DＭSＯ混合而成。
现配现用,或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。
使用前,于室温下水浴溶解;(4)待冻存细胞:各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
返回页首✧操作过程1、待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;(2)将细胞悬液以800～1000r/mｉｎ离心５ｍｉn,去上清夜;(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×106~1×１０7个/ml;(4)按每管1~1、５ml的量分装于冻存管内,拧紧管盖;(5)再冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。
２、分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(４～80C),约40ｍiｎ;(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(－10０C～－２00C),约30~６0mｉn;(3)将冻存管转入低温冰箱(-300C),放置30mｉn左右;(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱(-700C~-800C),过夜;(5)最后将冻存管投入液氮保存。
3、记录做好冻存记录。
记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。