高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)_百替生物

高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)

货号：M050012

描述：Hanahan法（1）是制备高效感受态细菌的标准方法。这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/µg DNA，通常用于构建高质量的基因文库，对于普通的克隆操作更是绰绰有余。对于很难获得有效连接和重组子的困难克隆操作，使用Hanahan法制备的感受态细菌无疑为克隆成功提供了最大保证。然而Hanahan法的试剂准备相当繁琐，通常用于商业化感受态细菌，通常实验人员难得尝试。本试剂盒以Hanahan原始文献(1)和《分子克隆实验指南》(2)发表的方法为基础，提供制备新鲜或冻存的高效感受态细菌的全套试剂和简化方案。重复性甚好，转化效率高，可满足基因文库构建和所有的克隆操作。

组成：20ml Hanahan缓冲液，0.5ml加强液。可制备100x50µl管高效感受态细菌，进行100-200次转化。

适用：制备新鲜或冻存的高效感受态细菌。

储存：短期4ºC避光，长期-20ºC。

操作步骤

1.细菌培养：

1.1准备器皿和培养基。(1)使用洁净培养器皿，用普通复印纸或报纸覆盖瓶口或管口棉线扎紧高压消毒。(2)厌氧生长的菌体难以达到高感受态。为保证有氧培养，最好使用250ml三角瓶加入50ml培养基摇菌。(3)最好用SOB培养基，用SOB要优于LB。培养基pH值在6.8-7.2，含有20mM MgSO4or20mM MgCl2,，有利于获得高效感受态。(SOB medium: 2%bacto-trytone,0.5%bacto-yeast extract,0.5%NaCl,

2.5mM KCl,20mM MgSO4,pH7.0with NaOH)

1.2细菌接种。取250ml三角瓶加入50ml含10~20mM MgSO4的SOB培养基。1:100接种冻存的菌液于SOB培养基，注意接种比例随冻存细菌浓度和类型而变。接种细菌量过多不利获得感受态。勿使接种之后尚未摇菌培养基已经混浊。由于不清楚的原因，直接从冻存的细菌原种接种培养的细菌，所得到的转化效率最高于使用连续传代、4ºC或室温贮存的培养物。

1.3摇动培养37ºC200~250rpm。不时监测OD550约为0.3-0.5时停止培养，OD550超过0.6不利于获得感受态。根据菌株的类型通常需要2~4小时，可据此调整初始细菌接种量。重要：欲获得更高效的感受态和转化效率(>109cfu/µg DNA)，可在18~32ºC室温而非37ºC培养细菌。调整房间空调温度到18~32ºC。在28ºC培养足够长的时间使OD550达到0.5-0.7，可能需要培养(8-10hours)或过夜。

1.4将摇菌瓶置冰水浴10分钟。下述步骤需无菌操作。按照比例选用合适的离心管和加液体量。

1.5将菌液装入合适大小的离心管，4ºC，4000rpm10分钟回收细菌，弃培养液，将管倒置使残留培养液流尽。

2.每50ml菌液获得的细菌沉淀，用1/3体积约15ml冰冷的转化缓冲液轻轻振荡重悬沉淀，将重悬细胞冰浴10分钟。

3.回收细菌4ºC，4000rpm10分钟，弃上清，将管倒置使残留液体流尽。

4.用原菌液1/10体积约5ml冰冷的转化缓冲液轻轻振荡重悬沉淀。置冰水浴。

5.加强感受态：按比例每1ml Step-4获得的菌液加35μl Enhancer。将175μl Enhancer加到细菌悬液的中心，轻轻混匀，冰浴10分钟。再次将175μl Enhancer溶液加到细菌悬液的中心，轻轻混匀，冰浴5分钟。

6.感受态细菌制备完毕。可立即使用或冻存。分装：取离心管置冰上预冷，每管50μl分装。50μl感受态细胞悬液对大多数克隆用途已绰绰有余，25μl感受态细胞可满足所有纯化质粒DNA的转化。冻存：迅速将分装感受态细胞的小管没入液氮速冻，然后贮存于−70ºC，12个月内转化效率无明显降低。可冻存于−20ºC但−20ºC长期保存时转化效率降低较快。

7.转化：取50μl新鲜或冻存融化的感受态细胞，放冰上。加入DNA连接混合物或质粒DNA溶液(100pg~10ng)。用手指轻弹试管混匀，勿振荡。冰浴30分钟。注意加入的转化混合物或DNA的体积不应超过细菌溶液体积的5%，否则将降低转染效率。50μl感受态细胞通常可被约l ng质粒DNA饱和。再加更多DNA也不增加反而会降低转化效率。注意加入阳性或阴性对照。

8.热休克：将管放入预加温到42ºC的循环水浴中，恰恰放置45-60秒，不要摇动试管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。

电转化：将DNA-菌液加入电转化杯，电转化装置4,000to16,000V/cm简短电转化。

9.复性：每管加800μl不含抗生素的培养基(SOC、SOB、LB)。用水浴加温至37ºC，然后将管转移到37ºC摇床200rpm45分钟，使细菌复苏并表达抗生素抗性标记基因。

10.取适量菌液涂于含合适抗生素的LB平板。倒置平板37ºC培养过夜。

说明

1.MC1061菌株不适于此法。

2.适宜的菌株包括但不限于：DH5,DH5 ,DH10,DH10B,HB101,RR1,JV30,DH11S,DM1,DH10B/p3,SCS1,Stb1-2,

DH12S,XL1-Blue,SURE Strain,SURE2Strain,XL2-Blue,AG1,JM101,JM109,JM110/SCS110,NM522,TOPP Strains,ABLE Strains,XL1-Red,BL21。

参考文献：

1.Hanahan D.Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J.Mol.Biol.1983,166:557-580

2.Sambrook J and Russell DW.Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,3rd ed.2001by Cold Spring Harbor Laboratory

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