甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍

毕赤酵母表达知识归纳

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

毕赤酵母表达实验手册

毕⾚酵母表达实验⼿册毕⾚酵母表达实验⼿册Jnuxz丁⾹园虚拟社区蛋⽩质技术讨论版⼤肠杆菌表达系统最突出的优点是⼯艺简单、产量⾼、周期短、⽣产成本低。

然⽽，许多蛋⽩质在翻译后，需经过翻译后的修饰加⼯，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋⽩酶⽔解等过程才能转化成活性形式。

⼤肠杆菌缺少上述加⼯机制，不适合⽤于表达结构复杂的蛋⽩质。

另外，蛋⽩质的活性还依赖于形成正确的⼆硫键并折叠成⾼级结构，在⼤肠杆菌中表达的蛋⽩质往往不能进⾏正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋⽩，就需要进⾏变性溶解及复性等操作，这⼀过程⽐较繁琐，同时增加了成本。

⼤肠杆菌是⽤得最多、研究最成熟的基因⼯程表达系统，当前已商业化的基因⼯程产品⼤多是通过⼤肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量⾼、易于操作。

但⼤肠杆菌是原核⽣物，不具有真核⽣物的基因表达调控机制和蛋⽩质的加⼯修饰能⼒，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应⽤。

近年来，以酵母作为⼯程菌表达外源蛋⽩⽇益引起重视，原因是与⼤肠杆菌相⽐，酵母是低等真核⽣物，除了具有细胞⽣长快，易于培养，遗传操作简单等原核⽣物的特点外，⼜具有真核⽣物时表达的蛋⽩质进⾏正确加⼯，修饰，合理的空间折叠等功能，⾮常有利于真核基因的表达，能有效克服⼤肠杆菌系统缺乏蛋⽩翻译后加⼯、修饰的不⾜。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利⽤。

［1］。

同时与⼤肠杆菌相⽐，作为单细胞真核⽣物的酵母菌具有⽐较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加⼯修饰能⼒。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分⼦遗传学⽅⾯被⼈们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第⼀个外源基因----⼲扰素基因［2］，随后⼜有⼀系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

⼲扰素和胰岛素虽然已经利⽤酿酒酵母⼤量⽣产并被⼴泛应⽤，当利⽤酿酒酵母制备时，实验室的结果很令⼈⿎舞，但由实验室扩展到⼯业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母表达蛋白步骤

毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。

其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。

本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。

二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。

首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。

然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。

同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。

三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。

转化方法包括电击转化、化学转化等。

其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。

转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。

四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。

接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。

常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。

五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。

同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。

六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。

功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。

七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。

通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。

但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。

因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。

毕赤酵母表达系统使用心得

毕⾚酵母表达系统使⽤⼼得Pichia酵母表达系统使⽤⼼得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为⼈熟知，并⼴泛应⽤于外源蛋⽩的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量⾼，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到⾼表达的。

不少⼈在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分⽤户在使⽤EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕⾚酵母表达的经典试剂盒过程中的⼼得体会。

其中Xiang Yang是来⾃美国乔治城⼤学（Georgetown University）Lombardi癌症中⼼（Lombardi Cancer Center），部分⽤户来⾃国内。

+ 表⽰优胜于；- 表⽰不如；= 表⽰差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使⽤简单，表达量⾼，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋⽩有时会出现蛋⽩切割问题全⾯产品报告及⼼得体会：巴斯德毕⾚酵母（Pichia pastoris ）是⼀种能⾼效表达重组蛋⽩的酵母品种，⼀⽅⾯由于其是属于真核⽣物，因此表达出来的蛋⽩可以进⾏糖基化修饰，另⼀⽅⾯毕⾚酵母⽣长速度快，可以将表达的蛋⽩分泌到培养基中，⽅便蛋⽩纯化。

毕⾚酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，⽽且在MCR5'端引⼊了alpha factor （α-factor ）⽤以增加表达，并且在表达后α-factor 可以⾃动被切除。

在进⾏克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在⽬标蛋⽩中增加两个氨基酸序列即可完成。

另外pPICZ 系列选⽤的是Zeocin 抗⽣素作为筛选标记，⽽诱导表达的载体需要甲醇——甲醇⽐⼀般⽤于⼤肠杆菌表达诱导使⽤的IPTG 便宜。

毕赤酵母对甲醇胁迫的响应及其对蛋白表达的影响

ＨＡＮＭｉｎｇ⁃ｈａｉ，ＷＡＮＧＷｅｉ⁃ｘｉａｎ，ＦＵＸｉａｎｇ⁃ｒｏｎｇｅｔａｌ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕｉｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏ⁃
ｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５００００）
迫，例如代谢产物、不适温度、ｐＨ和离子强度等胁迫，这些胁
迫可能会显著影响细胞的生理特性，包括蛋白合成和分泌表
达能力，该问题已经受到越来越多的科研工作者的关注。毕
赤酵母是甲基营养型酵母，能以甲醇作为唯一碳源和能源，
同时，甲醇也是诱导毕赤酵母外源蛋白表达最常用的诱导
物，但甲醇本身对宿主也会产生胁迫效应。因此，若要获得
物饥饿等［２０］都会激发此通路。ＵＰＲ下游靶基因功能涵盖大
在细胞质中被甲醛脱氢酶（ＦＬＤ１）催化为甲酸，接着被甲酸
等，对细胞生理特性影响也十分广泛，有些效应并不与蛋白
被醇氧化酶（ＡＯＸ１和ＡＯＸ２）转化为甲醛和过氧化氢。甲醛
脱氢酶转化为二氧化碳和水，并释放能量；或是甲醛在二羟
丙酮合成酶（ＤＡＳ１）作用下与５－磷酸木酮糖合成３－磷酸甘
Ｌｉ等［１５］研究发现，在甲醇诱导阶段，毕赤酵母能量代谢途径
普遍下调。
２．３诱发氧化胁迫响应（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ）毕赤酵
母需要提高过氧化物酶水平来抵御甲醇的毒害作用［１６］。在
部分新生肽合成、折叠、翻译后修饰、运输途径和ＥＲＡＤ途径
表达有直接的关联。
ｃｈａｉｎＦｖａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔ）［１０］均能获得理想的表达水平。
Ｖａｎｚ等［１１］报道，诱导表达乙肝表面抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅ

毕赤酵母从入门到提高

螺旋讲堂2010年第1期总第20期w w w .h e l i x n e t .c n 生物人的网上家园毕赤酵母表达从入门到提高爱因思念螺旋网HelixNet本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。

若本文侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email ：kaosy@ 告知。

此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷，敬请不吝赐教，联系方式：kaosy@ 同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能保证实验100%的成功，仅供参考。

写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可以让大家理解一些不常见的符号及意义。

下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL一、甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。

目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.主要优点1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。