大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作
发酵罐的操作及控制
发酵罐的操作及控制一、实验目的1、学习发酵过程中发酵控制、取样、流加等一般操作过程。
2、了解和学习自动发酵罐的操作过程和注意事项。
二、实验原理（一）发酵控制1、发酵温度的控制一般来说，接种后应适当提高培养温度，以利于孢子的萌发或加快微生物的生长、繁殖，而且此时发酵的温度大多数是上升的。
随着发酵液的温度逐渐上升，发酵液的温度应该控制在微生物的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段温度的控制可比最适生长温度低些，即控制在微生物代谢产物合成的最适温度；到发酵的后期，温度出现下降的趋势，直至发酵成熟即可放罐。
工业发酵过程一般无须加热，因为释放的发酵热常常超过微生物的最适生长温度，所以需要冷却阶段较多。
通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温（如采用夹套或蛇形管进行调温），冬季发酵时空气还需进行加热处理，以便维持发酵的正常温度。
2、发酵pH值控制首先应根据不同微生物的特性，不仅要控制原始培养基的pH值，而且在整个发酵过程中，必须随时检测pH值的变化情况，根据发酵过程中的pH值变化规律，选用适当的方法对pH值进行调节和控制。
3、提高溶解氧的措施控制溶解氧的工艺手段主要是从供氧和需氧两方面来考虑。
影响溶解氧效果的主要因素有：（1）通气流量（通风量）；（2）搅拌速度；（3）气体组分中的氧分压；（4）罐压；（5）温度；（6）培养基的物理性质等。
而影响需氧的则是菌体的生理特性，诸如不同菌龄的呼吸强度差别，基质加入时菌丝耗氧的增加等。
4、二氧化碳浓度控制CO2在发酵液中的浓度变化受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度；罐压大小、设备规模等。
对CO2浓度的控制主要看其对发酵的影响，如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之应设法降低其浓度。
5、泡沫的控制泡沫产生的原因：通气和搅拌、培养基成分、培养基的灭菌方法、培养液的温度、酸碱度、浓度等对发酵过程的泡沫形成也有一定的影响泡沫的消除和防止：了解发酵过程中泡沫的消长规律，方可有效的控制泡沫。
大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程
大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程本文主要介绍大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题的相关知识，包括实验目的、原理、方法和操作步骤等内容。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《大肠杆菌发酵生产工艺优化设计实验题酶工程》篇1一、实验目的本实验旨在通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，提高目标酶的产量和纯度，为工业生产提供基础数据和方法。
二、实验原理大肠杆菌是一种常用的表达宿主，广泛应用于酶工程领域。
目标酶是一种重要的工业酶，具有广泛的应用前景。
通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，可以提高目标酶的产量和纯度，从而降低生产成本和提高产品质量。
三、实验方法1. 菌种选育：采用基因工程技术构建高产目标酶的大肠杆菌菌株，并通过筛选和鉴定确定最佳菌株。
2. 发酵条件优化：对大肠杆菌发酵生产目标酶的关键条件进行优化，包括温度、pH、碳源、氮源和诱导剂等。
3. 工艺优化设计：采用响应面法 (RSM) 对发酵工艺进行优化设计，确定最佳的发酵条件和操作参数。
4. 目标酶的分离和纯化：通过离心、过滤、沉淀等方法分离和纯化目标酶，并采用 SDS-PAGE、HPLC 等方法进行分析和鉴定。
四、实验操作步骤1. 菌种选育：构建高产目标酶的大肠杆菌菌株，筛选和鉴定最佳菌株。
2. 发酵条件优化：对大肠杆菌发酵生产目标酶的关键条件进行优化，包括温度、pH、碳源、氮源和诱导剂等。
3. 工艺优化设计：采用响应面法 (RSM) 对发酵工艺进行优化设计，确定最佳的发酵条件和操作参数。
4. 目标酶的分离和纯化：通过离心、过滤、沉淀等方法分离和纯化目标酶，并采用 SDS-PAGE、HPLC 等方法进行分析和鉴定。
五、实验结果与分析通过优化大肠杆菌发酵生产工艺，可以显著提高目标酶的产量和纯度。
响应面法 (RSM) 是一种有效的工艺优化设计方法，可以确定最佳的发酵条件和操作参数。
基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化
基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化迟 雷，王静雨，侯俊超，魏佳佳，魏 涛，胡晓龙，何培新*（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州450000）摘 要：基于人工神经网络和遗传算法，对重组大肠杆菌（Escherichia coli ）BL 21表达热稳定普鲁兰酶的高密度发酵工艺进行优化。
在5 L 的发酵罐中，通过比较不同发酵温度、pH 值及培养基碳氮比（C /N ，mol /mol ）对细胞量和产物产量的影响，确定最佳发酵工艺。
结果表明，诱导前适合细胞生长的发酵条件为发酵温度34.4 ℃、pH 6.87、培养基C /N 6.1；诱导后适合产物表达的发酵条件为发酵温度32.5 ℃、pH 6.69、培养基C /N 5.3，最终获得细胞质量浓度56.5 g /L ，重组蛋白产量3.21 g /L ，酶活力为268.3 U /mL 。
关键词：重组普鲁兰酶；神经网络；遗传算法；高密度发酵Artificial Neural Network-Genetic Algorithm-Based Optimization of High Cell Density Cultivation ofRecombinant Escherichia coli for Producing PullulanaseCHI Lei, WANG Jingyu, HOU Junchao, WEI Jiajia, WEI Tao, HU Xiaolong, HE Peixin *(School of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000, China)Abstract: In this study, the high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli BL 21 for the production of a novel thermostable pullulanase was optimized using artificial neural network and genetic algorithm. The effects of culture temperature, medium pH, and carbon-to-nitrogen (C /N) molar ratio were tested in a 5 L bioreactor. The results suggested that the optimal culture conditions before the induction phase were as follows: temperature 34.4 ℃, pH 6.87 and C /N ratio 6.1, and the optimal culture conditions after induction were 32.5 ℃, pH 6.69 and 5.3 C /N ratio. The maximum biomass, protein concentration and pullulanase activity obtained under these conditions were 56.5 g /L, 3.21 g /L and 268.3 U /mL, respectively.Keywords: recombinant pullulanase; neural network; genetic algorithm; high cell density cultivation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200101-006中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）10-0073-06引文格式：迟雷, 王静雨, 侯俊超, 等. 基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2021, 42(10): 73-78. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200101-006. CHI Lei, WANG Jingyu, HOU Junchao, et al. Artificial neural network-genetic algorithm-based optimization of high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli for producing pullulanase[J]. Food Science, 2021, 42(10): 73-78. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200101-006. 收稿日期：2020-01-01基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31801535）；河南省重大科技专项（181100211400）；河南省教育厅科技创新人才项目（18HASTIT040）；郑州轻工业大学博士科研启动基金项目（2013BSJJ004）第一作者简介：迟雷（1983—）（ORCID: 0000-0002-7824-2785），男，副教授，博士，研究方向为发酵工程。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化大肠杆菌是一种重要的常见细菌，广泛应用于基因工程和分子生物学研究中。
质粒DNA是大肠杆菌中常见的DNA形式，因其易于提取和处理，被广泛用于携带目的基因、表达目的蛋白等。
在提取质粒DNA的过程中，有许多影响提取效果的因素，包括质粒DNA含量、纯度、提取时间等。
对于提取条件的优化非常重要。
1. 大肠杆菌培养条件的优化：- 选择适宜的培养基和培养条件。
适宜的培养基和条件可以提高大肠杆菌的生长速度和菌体数量，从而增加质粒DNA的产量。
- 控制培养菌株的密度。
过高或过低的菌株密度都会影响质粒DNA的提取效果。
一般来说，菌株密度应控制在0.5至1.0的OD值范围内。
- 质粒DNA培养菌株选择。
有些大肠杆菌菌株携带质粒比较多，可以提高质粒DNA 的产量。
2. 细胞破碎条件的优化：- 选择适当的破碎方法。
目前常见的细胞破碎方法包括化学法、物理法和酶解法。
根据实验需求和样本特点选择适当的破碎方法。
- 控制破碎时间和速度。
破碎时间过长可能会导致质粒DNA降解，破碎速度过快可能会造成未完全破碎的细胞残渣留在溶液中，影响提取效果。
3. 质粒DNA纯化条件的优化：- 使用适当的提取试剂。
根据需要和实验室条件选择适当的提取试剂，常用的有盐酸、醋酸、硫酸、异丙醇等。
- 选择合适的提取方法。
常用的质粒DNA提取方法有酚/氯仿法、盐析法、硅胶柱法等。
根据实验需求选择合适的提取方法。
- 控制提取温度和时间。
温度和时间过高可能会降解质粒DNA。
4. 质粒DNA纯化后的处理：- 使用适当的缓冲液储存。
一般来说，用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）储存质粒DNA，可保持其稳定性较好。
- 采取合适的测量方法。
可以通过分光光度计、凝胶电泳等方法来测量提取到的质粒DNA的含量和纯度。
在实际操作过程中，还可以根据实验需求对提取条件进行进一步优化。
注意在提取过程中的操作规范和消毒措施，以确保实验的准确性和安全性。
大肠杆菌发酵工艺
大肠杆菌发酵工艺大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于发酵工业中。
发酵工艺是指利用微生物在一定条件下进行代谢反应，产生有用的物质。
大肠杆菌发酵工艺是一种高效、经济、环保的生产方式，已经成为现代生物技术的重要组成部分。
一、大肠杆菌的特点大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，是肠道中最常见的细菌之一。
它的形态为短杆状或圆形，大小约为1-2微米。
大肠杆菌是一种好氧菌，需要氧气进行代谢反应。
它的代谢途径非常多样化，可以利用多种碳源、氮源和能量源进行生长繁殖。
大肠杆菌的遗传物质DNA非常稳定，可以在短时间内进行大量复制，是基因工程的理想载体。
二、大肠杆菌的应用大肠杆菌广泛应用于食品、医药、化工等领域。
在食品工业中，大肠杆菌可以用于制作乳酸菌饮料、酸奶、酵母等发酵食品。
在医药工业中，大肠杆菌可以用于生产抗生素、激素、疫苗等药品。
在化工工业中，大肠杆菌可以用于生产丙酮、丁酸、异戊酸等有机酸。
三、大肠杆菌发酵工艺大肠杆菌发酵工艺是一种复杂的生物反应过程，需要严格控制各种因素。
下面介绍大肠杆菌发酵工艺的主要步骤和影响因素。
1、接种接种是大肠杆菌发酵工艺的第一步。
接种前需要进行预处理，保证接种菌株的活力和纯度。
接种量的大小直接影响到发酵的速度和产量。
一般情况下，接种量为发酵罐总容积的1%-5%。
2、培养基配方培养基是大肠杆菌发酵工艺的重要组成部分。
不同的菌株需要不同的培养基。
培养基的主要成分包括碳源、氮源、无机盐和生长因子。
碳源可以是葡萄糖、麦芽糖、果糖等；氮源可以是氨基酸、蛋白质水解物等；无机盐可以是磷酸盐、硫酸盐等；生长因子可以是维生素、酵素等。
培养基的配方要根据不同的菌株和不同的产品要求进行调整。
3、发酵条件发酵条件包括温度、pH值、氧气含量、搅拌速度等因素。
大肠杆菌的适宜生长温度为37℃，pH值为7.0左右。
氧气含量和搅拌速度也会影响到发酵的速度和产量。
过高的氧气含量会导致大肠杆菌代谢产生过多的乳酸，影响到产量和质量。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化大肠杆菌是一种常见的细菌，其质粒DNA在分子生物学领域中有着重要的应用价值。
质粒DNA的大量提取对于基因克隆、转基因技术等工作至关重要。
大肠杆菌中质粒DNA提取的条件并不是一成不变的，需要根据实验的具体需求进行优化。
本文将就大肠杆菌中质粒DNA提取条件的优化进行探讨，并提出一些可行的优化方案。
一、样品的处理在进行大肠杆菌中质粒DNA提取前，样品的处理至关重要。
首先要保证样品的纯度和完整性，避免有杂质的污染和DNA的损伤。
其次要注意细菌培养的条件，包括培养基的选择、培养温度、培养时间等。
这些都会影响到大肠杆菌中质粒DNA的提取效果。
优化方案：1. 选择优质的大肠杆菌菌株，确保其存储和传代的完整性，避免冻融次数过多导致DNA的降解。
2. 严格控制细菌的培养条件，包括选择适宜的培养基、培养温度和培养时间，以保证大肠杆菌菌体的生长和稳定性。
二、细胞破碎及质粒DNA的分离在提取大肠杆菌中质粒DNA的过程中，细胞破碎和质粒DNA的分离是关键的步骤。
细胞破碎要充分且均匀，以确保质粒DNA能够充分释放。
而质粒DNA的分离则需要选用合适的方法，避免RNA、蛋白质等杂质的干扰。
优化方案：1. 选用适当的细胞壁破碎方法，如化学法、超声波法、冻融法等，以确保细胞破碎充分且均匀。
2. 选择合适的离心条件，将RNA、蛋白质等杂质有效分离，避免对后续实验产生干扰。
三、DNA的纯化经过细胞破碎和质粒DNA的分离后，需要对质粒DNA进行进一步的纯化处理。
纯化的过程中需要去除RNA、蛋白质等杂质，以获得高质量的质粒DNA样品。
优化方案：1. 选择适当的DNA纯化试剂盒，根据厂家提供的操作手册进行操作，尽量避免RNA、蛋白质等杂质的污染。
2. 对已经纯化的DNA进行检测，确保其完整性和纯度。
四、保存条件提取到的大肠杆菌中质粒DNA在保存过程中也需要注意一些条件，以确保其质量和稳定性。
优化方案：1. 采用合适的保存液保存质粒DNA样品，避免冻融次数过多导致DNA的降解。
重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件
重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件概述：
谷胱甘肽合成酶是一种重要的酶类蛋白，广泛应用于医学、食品、化工等领域。
本文将针对大肠杆菌的摇瓶发酵条件进行重新的优化，以提高谷胱甘肽合成酶的产量。
一、菌株选择及预处理
1.选用具有谷胱甘肽合成能力的大肠杆菌作为研究对象。
2.将菌株预处理后接种到摇瓶中。
二、培养基配制
1.基础培养基的配制：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、
10g/L葡萄糖、pH=7.2。
2.添加谷氨酰胺、L-半胱氨酸、硫酸镁等微量元素物质以提高谷胱甘肽合成功能。
三、发酵条件
1.发酵时间：选用24h、36h、48h等不同时间段进行观察和分析。
2.发酵温度：30℃、37℃、40℃等不同温度对菌株的产量影响。
3.振荡频率：发酵过程中的振荡频率可以促进氧气的输送，增加菌体的代谢效率。
四、收获和分析
1.收集并离心菌体，进行酶与蛋白质的提取。
2.利用SDS-PAGE对蛋白质进行检测，观察酶蛋白的表达情况。
3.利用UV-Vis光谱对酶活性进行检测，分析不同条件下产量的影响。
五、总结
上述方法有效地优化了大肠杆菌合成谷胱甘肽酶的生产条件，提高了酶的产量和活性，为谷胱甘肽合成酶的实际应用提供了有力保证。
此方法对于其他生物酶的生产也有一定的参考价值。
大肠杆菌高密度发酵产木聚糖酶发酵条件优化
大肠杆菌高密度发酵产木聚糖酶发酵条件优化刘国锋【摘要】The fermentation conditions,such as,inoculum,pH value,culture temperature,dissolved oxygen,induction time and specific growth rate in the production of xylanase industry were optimized by single factor experiments.On the basis of the single factor experiments,the specific growth rate,dissolved oxygen and pH were optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum fermentation conditions were inoculum 10％,dissolved oxygen 30％ during fermentation,growing period pH value 7.0,growing period culture temperature 37 ℃,growing period specific growth rate 0.12 h-1,induction period pH value6.8,induction period culture temperature 35 ℃ and induction period specific growth rate 0.14 h-1.The induction medium was added in the middle of logarithmic phase (OD600nm=30).After optimization,the highest xylanase activity could be up to 149 000 IU/ml.The study improved the xylanase activity under the conditions of mass production,which provided guidance for the industrial production of xylanase.%该试验对木聚糖酶工业大生产条件下的接种量、pH值、培养温度、溶氧、诱导时间、比生长速率进行了单因素优化试验.在此单因素试验基础上,选取对酶活影响较大的比生长速率、溶氧和pH 3个因素进行了正交试验优化.结果表明,优化后的发酵条件为接种量10％,发酵过程中溶氧值30％,生长期控制pH值为7.0,生长期培养温度37℃,生长期比生长速率为0.12h-1,诱导期pH值为6.8,诱导期培养温度为35℃,诱导期比生长速率为0.14h-1,在对数生长中期(OD600nm=30)时流加诱导培养基.优化后,放罐木聚糖酶活力最高可达149 000 IU/mL.该研究提升了大生产条件下的木聚糖酶活力,为木聚糖酶的工业化生产提供了指导.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)012【总页数】5页(P63-67)【关键词】大肠杆菌;木聚糖酶;发酵条件;优化【作者】刘国锋【作者单位】湖南尤特尔生化有限公司,湖南岳阳414000;山东尤特尔生物科技有限公司,山东邹城273500【正文语种】中文【中图分类】TS201.3木聚糖水解酶是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的细菌和真菌中。
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发酵操作 ������
当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后， 进行如下操作： 1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残 液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶， 开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
溶氧控制的分批补料培养
控制的几个关键参数如下： 1、温度：培养温度为37 ℃。 2、pH：自动流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流 加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~4h 不加补料，4~10h补加含50g葡萄糖的补料， 10~20h加入含190g葡萄糖的补料，诱导前 0.5h追加100ml补料。
大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物 乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 预防措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长 速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值 时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度， 控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析 技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实 现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程 中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个 较低的水平上，以减少乙酸的产生。
培养基配制
配制种子固体培养基100mL ， 分装试管， 0.1MPa 灭菌20min，然后摆成斜面。 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个 250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下 550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作 二级种子用），同上灭菌。
培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。 大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工 艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中 的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一 方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现 象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞 的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各 样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。 培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补 料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培 养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。
发酵过程中各生化指标的测定
（7）当发酵到一定时候，光密度值达到1～ 1.5，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时， 开始补料，并在发酵结束前一小时终止。 （8）每小时记录发酵过程温度、pH和DO的测 定数值，并记录操作情况。
大肠杆菌流加发酵策略
大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株， 广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培 养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生， 因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度 乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研 究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大 肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所 采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保 持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最 好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可 以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于 饥饿状态。
大肠杆菌高密度发酵
第二组 小组长：李青 小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建 贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、 郭荣欣
目录
大肠杆菌 高密度发酵 培养基选择 培养基配置 培养方式 培养条件 操作流程 具体步骤 参数控制 注意事项
大肠杆菌
大肠杆菌是基因工程中常用 的宿主菌,许多有价值的多肽和 蛋白在大肠杆菌中已成功地进 行了表达,表达水平有些高达细 胞总蛋白的30%以上. 大肠杆 菌作为外源基因表达的宿主,由 于具有遗传背景清楚,目的基因 表达水平高,技术操作、培养条 件简单,抗污染能力强,大规模 发酵经济等优点,倍受遗传工程 专家重视,是目前应用最广泛, 最成功的表达体系.
发酵过程中各生化指标的测定
发酵过程中，虽然能自动控制温度和pH两个 重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作： （1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控 制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。 （2）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰 氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有 杂菌污染。 （3）随着培养时间的延长，适当地调节进气量 和搅拌转速，以维持一定的DO值。
9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面 板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使 胶管内充满液体，将输出上限设在15%， 下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手 动”开关调节到“自动”状态。 10、设定搅拌转速为300r/min、空气流量 2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入 发酵状态。
发酵过程中各生化指标的测定
（4）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含 量。测定步骤如下： ①发酵液中糖含量小于 4％时，直接取发酵液 0.5 ml于锥 形瓶中，若糖含量大于 4％时，先稀释10倍后，取稀释液 0.5ml于锥形瓶中。 ②向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各 5ml，混匀，加热 至沸腾。 ③用0.1％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖 液的体积数（V）。 ④取0.5 ml蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗 葡萄糖的体积数（V0）。 ⑤按下公式进行计算：(V0-V)x0.1/0.5x稀释倍数 V0 为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。V为葡萄糖滴定 样品时消耗的毫升数。
放罐
发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵 液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢， 且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准 备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后， 100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可 排放入下水道。
发酵过程中各生化指标的测定
（5）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下： ①取发酵液经3500 r／min离心 10min。 ②分别吸取上清液 2.0 ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各 加蒸馏水 5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7 ml蒸馏 水，作空白对照。 ③向上述 3个瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml，混匀，加 0.5 ％溴麝香草酚兰液 2滴和 0.5％酚酞液4滴。 ④用标准 0.100mol／L NaOH溶液滴定至紫色，分别记录 消耗的NaOH液毫升数。 ⑤按下式计算: (V0-V)x1.4008 V为滴定发酵液时消耗NaOH溶液的毫升数。V0 为滴定空白 时消耗NaOH溶液的毫升数。1.4008为 1ml 0.1mol／LNaOH 溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。
发酵罐
上罐前的准备及实罐灭菌
5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时， 2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时， 微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持 罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷 凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定 在37℃，切入自动。 6、当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4， 使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。
培养基选择
LB培养基(种子培养基) :胰蛋白胨5g, 酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调 节pH7.0, 2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭 菌121℃, 20min,室温保存. TB培养基(发酵培养基) : 胰蛋白胨 240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡剂1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun发酵罐在位 灭菌121℃, 15min.
菌种准备
1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，37℃培养24h。 2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级 种子瓶， 37℃振荡培养10h。
上罐前的准备及实罐灭菌
1、洗净发酵罐及各联接胶管 2、 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴 泡敌。 3、校正pH电极和溶氧（DO）电极。 4、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等 固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1， 使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用 倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启 动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min， 开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在 位灭菌。
发酵过程中各生化指标的测定
（6）测定OD值 ⑴ 大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与105℃烘 2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平 上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发 酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗 涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊 子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精 确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液， 稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。以0D 值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。 ⑵ 均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一 定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与 吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。 ⑶ 其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上 清液装入编号三角瓶，用于测糖。
培养条件
1、温度：36~38 ℃ 2、pH： 7 3、搅拌速率：100~200r/min 4、溶氧: 20~50% 5、通风：2~3L/min 6、接种量：1~2%
操作步骤
1、菌种准备 2、上罐前的准备及实罐灭菌 3、发酵操作 4、发酵管理 5、发酵过程中各生化指标的测定 6、补料 7、放罐 8、清洗
发酵管理
控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、 空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及 时排除。 每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计 旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管 残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松 开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开 J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样 时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样 要及时清洗量筒。 每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、 通风、转速的测定数值，并记录操作情况。