植物原生质体融合技术 PPT课件 (2)
6 植物组织培养实验二PPT课件
谢谢你的到来
学习并没有结束，希望大家继续努力
Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
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2、无菌操作要注意：每次操作前， 将双手用酒精棉球擦拭消毒；镊 子、解剖剪刀等金属工具用火焰 烧过灭菌，冷却后方可使用；尽 量减少无菌三角瓶或培养皿在空 气中的暴露时间；所有无菌操作 尽量快速完成，并要求在酒精灯 附近进行。
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3、请先在自然条件下练习外植体解剖， 分割成0.5cm2左右的小块（段），经操 作熟练，检查无误后，再进行无菌解 剖分割及接种，以减少植物材料染菌 或失水死亡的机率。
欢迎同学们进入奇幻的植物组织培养实验世界
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植物组织培养实验Ⅱ——— 外植体取材﹑表面消毒与接种
实验目的 实验原理、基本知识 实验用品、材料 实验要求 实验内容 、方法 实验报告——作业 下一次实验预告
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一、实验目的
1、掌握无菌操作技术，加深对无菌操作的了
解；
2、掌握常规的植物细胞组织培养技术，达到 能独立操作的能力
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7、打开三角瓶——铝箔纸的拿法
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8、瓶口在火焰上烧过
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9、铝箔纸的放法
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10、镊出黄瓜苗
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11、镊出黄瓜苗
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12、放入培养皿中
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13 、
黄 瓜
幼 苗 形 态
生 长 点
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——
14、剪取茎段
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15、剪好的外植体
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16、黄瓜切块的接种
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
植物原生质体的分离和融合
生质所包围的“裸露细胞”，是开 展基础研究的理想材料。其中酶解 法分离原生质体是一个常用的技术， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 半纤维素和果胶质组成，因而使用 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能 降解细胞壁成分，除去细胞壁。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有 醚键而具负极性，与水、蛋白质和 碳水化合物等一些正极化基团能形 成氢键，当PEG分子足够长时，可阼 为邻近原生质表面之间的分子桥而 使之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥， 因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜 上的PEG分子可被洗脱．这样将引起 电荷的紊乱和再分布． 从而引起原生质体融合：高Ca高pH 由于增加了质膜的流动性，因而也 大大提高了融合频率，洗涤时的渗 透压冲击对融合也可能起作用。
取滤液（两支）离心5分钟(1000rpm),弃上清
（关键）向沉淀中加入0.16M CaCl2溶液1-2毫 升，摇晃使沉淀悬浮，用注射器在离心管底部 注入6-8ml22%蔗糖溶液，
洗涤（0.24M CaCl2溶液），再次离心 （1000rpm离心2-5分钟），弃上清液 稀释（向沉淀中加入0.16M CaCl2溶液1-2毫 升，摇晃使沉淀悬浮） 取一滴与载玻片上，盖片显微观察，也可在 荧光显微镜下检查其纯度
许多化学、物理学和生物学方法可
诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚 乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融 合法：PEG作为一种高分子化合物， 20～50％的浓度能对原生质体产生 瞬间冲击效应，原生质体很快发生 收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进 行清洗．使原生质体融合得以完成。
植物体细胞融合技术
2.1．1植物细胞工程的基本技术--------植物体细胞融合技术学习目标1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。
2、尝试进行植物组织培养。
学习重点1、植物组织培养的原理和过程2、植物体细胞杂交的原理一、 植物体细胞杂交技术1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。
2．过程 不同的植物体细胞果胶酶纤维素酶−−−→−不同细胞原生质体−−−→−人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。
3．植物体细胞杂交步骤：(1)去掉细胞壁，分离出有活力的 ，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用 、 去除植物细胞的细胞壁。
(2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过 法和 法来诱导融合。
方法有： 等促使原生质体融合。
化学法是用(PEG)作为诱导剂来诱导融合。
融合后再生出 。
(3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。
如图在此过程中需要注意的问题有：①植物体细胞杂交过程中，植物体细胞融合所依据的生物学原理是 ；植物组织培养的理论基础是 。
②体细胞融合成功以后，既有AB 型杂种细胞，还能形成AA 型和BB 型两种融合细胞，但只有AB 型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个 过程。
③目前常用的去除细胞壁的方法是 ，保证了原生质体活性。
植物体细胞融合完成的标志是新细胞壁的形成。
④植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。
⑤植物体细胞杂交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决，离推广应用仍有一定距离。
【当堂检测】 1．不能．．用于人工诱导原生质体融合的方法是 （ ） A ．振动 B ．电刺激 C ．PEG D ．重压 2．与传统的有性杂交法相比，植物体细胞杂交的最大优点是 （ ） A ．可使两个亲本的优良性状组合到一起 B ．可以克服远缘杂交不亲和的障碍 C ．可以培育出高产性状明显的新品种 D ．可以降低生成成本，提高接济效益3．植物体细胞杂交的过程实质是 （ ）A ．细胞质融合的过程B ．细胞核融合的过程C ．细胞膜融合的过程D ．细胞原生质体融合的过程 4．原生质体融合后，需诱导产生细胞壁，参与此过程的细胞器是 （ ） A ．叶绿体、高尔基体 B ．线粒体、高尔基体 C ．叶绿体、线粒体 D ．线粒体、内质网 5．高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误．．的是 （ ）A ．该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B ．该愈伤组织的细胞没有全能性C ．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞D ．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 6．以下不能．．说明细胞具有全能性的实验是 （ ） A ．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B ．紫色糯性玉米种子培育出植株 C ．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D ．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株7．植物组织培养过程中的脱分化是指 （ ）A ．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B ．未成熟的种子经过长期培养，培养出幼苗的过程C ．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程D ．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程8．在脱分化形成愈伤组织的过程中，下列各项为非．必要条件的是（）A．培养基需要消毒灭菌B．给予适宜的温度C．给予充足的光照D．给予适宜的养料和激素9．通过植物体细胞杂交，获得一个杂种植株需要的步骤是（）A．分离原生质体→诱导原生质体融合→组织培养→得到杂种植物B．分离原生质体→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株C．获取细胞→原生质体融合→组织培养→杂种植株D．获取细胞→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株10．胚状体是在植物组织培养的哪一阶段上获得的（）A．愈伤组织B．再分化C．形成完整植株D．取离体组织11．利用植物的茎尖、茎段、花药、花粉等，在无菌的条件下，放在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
植物体细胞杂交技术课件(精美)
要想获得遗传物质来自两个不同物种 的“番茄—马铃薯”杂种植株（番茄、马 铃薯之间存在着天然的生殖隔离，有性杂 交无法成功），需要用什么技术手段？
就是将不同种的植物体细胞，在一定条件下
融合成杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新植
物你物体认的的为体两细方个胞来完法自成。不融同合植，
细胞均需酶处理 C 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞
融合可制备单克 隆抗体 D 某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种
杂交后代的染色体数目相同
自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼 虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞 中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以 实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实 验方案。
物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（PEG）
聚乙二醇 （PEG）
植物体细胞杂交过程
融合基础：细胞 膜具有流动性
植物细胞A 植物细胞B
纤维素酶 和果胶酶
原生质体A 原生质体B
三种类型：
AA、BB、AB
原生质体融合 人பைடு நூலகம்诱导
杂合的原生质体
物理法：离心、振动、电激
方 法
化学法：聚乙二醇（PEG）
杂种 脱分化 愈伤 再分化 胚状体 发育 杂种
细胞
组织
或丛芽
植株
1、若A细胞有20条染色体，B细胞有30条染色体，则杂种植株有 50 条染色体。 2、若A细胞基因型为DdEE，B细胞基因型为YYRR，则杂种植株的基Dd因E型EY为YRR 3、若A细胞有4个染色体组，B细胞有8个染色体组，则杂种植株有 12 个染色体组。 4、若植物A为六倍体，植物B为二倍体，则杂种植株有 为 八倍体
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
第十五章生物技术与作物育种ppt课件
（2）我国转基因作物研究与利用概况
转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现
（二）转基因育种程序
目的基因或DNA的获取 含有目的基因或者DNA的重组质粒的构 建 受体材料的选择和再生系统的建立 转基因方法的确定和外源基因的转化 转化体的筛选和鉴定
转基因植株的育种利用
1、目的基因的获得
（1）根据基因表达的产物---蛋白进行基因克 隆
生长调 生长素 IAA、NAA、2,4-D、IBA
节物质 细胞分裂 天然： 6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）
素
人工：ZT（玉米素）、2-iP
成份不 定物质
赤霉素 GA3 椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥
琼脂
从海藻中提取的一种高分子碳水化合物
（2）无菌操作 （3）无菌培养 二、细胞和组织培养与作物育种
第二节 转基因技术与作物育种
作物转基因育种：根据育种目标，从供 体生物中分离目的基因，经DNA重组与 遗传转化或直接运载进入受体作物，经 过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在 经过田间试验与大田选择育成转基因新 品种或种质资源。
常规育种技术相比，转基因育种具有很 大优势：
1.可以利用的基因资源大大拓宽。 2.为培育优良品种提供了崭新的育种途径。 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定 向选择。 4.可以大大提高选择效率，加速育种进程。
确定遗传方式
（5）耐旱
遗传稳定性测试 多点田间试验
育种新品系
继续田间试验、种子富集 区域试验
审定
投入生产
（二）单倍体细胞培养及育种利用 1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值 （1）后代的快速纯合 （2）提高选择效率 （3）排除杂种优势对后代选择干扰 （4）遗传研究的良好实验材料体系 （5）突变体的筛选
细胞融合 (2)
细胞融合一、细胞融合的定义细胞融合（Cell fusion）又称体细胞杂交（Somatic hybridization）：是指将不同来源的细胞或原生质体通过人工方法诱导融合形成杂种细胞，并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）二、细胞融合的类型根据所选用的亲本细胞或原生质的来源可分为以下4种：1、体细胞杂交利用双亲的体细胞或原生质进行融合，是真正意义上的细胞融合技术，目前细胞融合的大多数组合仍以体细胞杂交为主。
2、配子-体细胞杂交融合亲本一个为体细胞，另一个为性细胞（精、卵细胞），可获得三倍体细胞杂种。
3、配子间细胞杂交融合双亲本均为性细胞（精、卵细胞），配子间细胞杂交有多种组合形式。
其中以精、卵细胞进展最快。
例如：玉米4、微细胞杂交先诱导细胞中形成高频率的微核，再分离和制备具有此微核的细胞或原生质体，作为融合的亲本而进行体细胞杂交。
用于转移单个完整的染色体以建立单体或多体的“染色体杂种”。
三、细胞融合的基本原理细胞融和分为异核体形成与杂种细胞形成两个阶段。
异核体形成后有两种途径：或在短期培养后死亡，或存活下来。
存活的异核体经历有丝分裂，双亲染色体混杂，可产生两个称为合核体的单核杂种细胞。
其基本过程是：1、细胞在诱导剂或在正弦电场的作用下凝集，彼此靠近；2、两个相邻细胞的之间的质膜相互融和，随后两个亲本细胞质膜上的受体等质膜成分也在3、融和后的质膜上重新分布；4、细胞质发生融和；5、细胞核融和，形成单核融和细胞。
四、细胞融合的具体步骤：（１）细胞准备。
分贴壁和悬浮细胞两种。
前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。
（２）细胞融合，加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。
（３）杂种细胞选择。
利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。