一文读懂免疫组化步骤结果分析及注意事项
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化结果分析
免疫组化结果分析篇1:免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。
一、石蜡切片和冰冻切片的比较？要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫组化实验结果的判定和分析
免疫组化实验结果的判定和分析免疫组化实验是一种广泛应用于生物医学研究领域的分析方法，它用于检测和定量分析细胞或组织中特定分子的表达水平。
该实验主要通过特异性抗体与目标分子结合并产生可视化信号来实现。
在进行免疫组化实验的结果判定和分析时，需要考虑多个因素，如抗体的选择、染色的强度和分布等。
首先，在实验结果的判定和分析时，抗体的选择是非常重要的因素之一、选择合适的抗体可以确保实验结果的准确性和可靠性。
抗体需要具有高度的特异性，能够与目标分子结合形成稳定的抗原-抗体复合物。
此外，抗体还需要具有良好的亲和力和灵敏度，以便能够捕获并检测到目标分子的最低表达水平。
其次，实验结果的判定和分析需要考虑染色的强度和分布。
免疫组化实验中常用的染色方法有荧光染色和酶标染色等。
染色的强度可以反映目标分子在细胞或组织中的表达水平，而染色的分布则可以提示目标分子的亚细胞定位或组织定位。
通过评估染色的强度和分布，可以对目标分子的表达及其在生物学过程中的作用进行初步分析。
另外，实验结果的判定和分析还需要结合负对照和阳性对照组的结果。
负对照组通常是将待测样本中的目标分子结合位点堵塞或与非特异性抗体结合，以排除非特异性染色的可能性。
而阳性对照组则是使用已知表达目标分子的样本进行染色，以验证实验方法的可靠性。
通过与负对照和阳性对照组的比较，可以进一步确定实验结果的准确性和特异性。
此外，实验结果的判定和分析还可以应用定量分析方法。
免疫组化实验通常使用染色强度的定量参数，如光密度或荧光信号强度来评估目标分子的表达水平。
这可以通过计算图像中目标区域的颜色强度来实现。
定量分析可以帮助研究者确定目标分子在不同条件下的变化趋势，并进一步研究其与疾病发生和发展的关联。
最后，实验结果的判定和分析应该结合其他相关的实验数据和研究背景进行综合分析。
免疫组化实验的结果往往只能提供目标分子在组织或细胞中的表达水平，而无法直接确定其功能和作用机制。
因此，需要将实验结果与其他实验手段和研究结果相结合，以获得更全面的分析结果。
免疫组化检测注意事项
免疫组化检测注意事项嘿，咱今儿就来说说免疫组化检测那些事儿！这免疫组化检测啊，就像是一场对细胞的大探秘，可不能小瞧了它。
你想想，细胞那么小，要搞清楚它们的情况可不容易。
就好像在一个满是人的大广场上，要找出特定的几个人一样。
免疫组化检测就是我们的法宝啦！但要做好这个检测，可得注意好多细节呢。
首先说样本，那可是检测的基础啊！样本要是没采集好，就好比盖房子没打好地基，后面可就麻烦啦。
采集样本的时候可得小心再小心，别把不该采的采进去了，也别把该采的给弄丢了。
就跟做饭似的，食材不好，怎么能做出美味佳肴呢？然后就是实验过程啦，这可得像走钢丝一样，小心翼翼。
各种试剂就像是不同的调味料，加多加少都不行，得恰到好处。
温度、时间这些也都得把握好，不然结果能准吗？这就跟烤蛋糕一样，火候不对，蛋糕不就烤砸啦？还有啊，操作的时候一定要仔细认真，不能有一丝马虎。
一个小失误可能就会让结果大不一样，那可就误大事了。
这就像绣花，一针一线都得精心，不然绣出来的花能好看吗？检测人员也得专业呀，他们就像是经验丰富的侦探，能从那些小小的线索中找出真相。
要是个新手，那能行吗？那不等于让个小孩子去破案嘛！而且做完检测后，分析结果也很重要。
不能看到个结果就随便下结论，得综合考虑各种因素。
这就像解一道难题，得一步一步分析，不能着急。
咱可得重视免疫组化检测呀，这可是关系到健康的大事呢！只有把每个环节都做好，才能得到准确可靠的结果，才能更好地帮助医生诊断和治疗疾病。
不然，那不是白忙活一场嘛！大家说是不是这个理儿呀？所以啊，大家一定要牢记这些注意事项，让免疫组化检测发挥出它最大的作用！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
免疫组化的步骤
免疫组化的步骤免疫组化是一种在细胞和组织中检测特定蛋白质的方法。
它是通过使用特异性抗体来标记和检测目标蛋白质的存在和定位。
免疫组化在生命科学研究和临床实验室中被广泛应用，可以用于研究细胞周期、诊断疾病以及评估药物治疗效果。
本文将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步：取样和固定组织对于免疫组化分析，需要提取组织样本。
常见的样本来源包括组织切片、细胞培养物或动物实验的组织。
确保样本经过适当的处理和固定，以保持目标蛋白质的形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
第二步：抗原修复抗原修复是为了恢复固定样本中的蛋白质的原始结构和形态。
常见的修复方法包括热处理、酶消化等。
热处理是将样本在高温水浴中加热，以使蛋白质重新展开。
酶消化是通过酶的作用，去除样本中的一些交联或修饰物质，以恢复抗原的可识别性。
第三步：抗体的选择和标记在免疫组化中，选择一个适当的抗体是至关重要的。
抗体可以选择单克隆或多克隆抗体。
单克隆抗体可以与目标蛋白质结合的特异性更高，但价格相对较高。
多克隆抗体则具有更广泛的适用范围。
抗体可以标记有不同的标记物，如荧光染料、酶或金标记等。
标记抗体的选择应基于实验目的和检测方法。
第四步：抗体和样本的孵育将选择好的抗体加入到固定样本中，使其与目标蛋白质结合。
这一步又称为孵育步骤。
孵育时间和温度取决于抗体的亲和性和实验要求。
通常，较长的孵育时间会提高目标蛋白质与抗体的结合效率。
第五步：洗涤洗涤步骤的目的是去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质，以减少背景信号的干扰。
洗涤缓冲液的选择应根据实验要求和样本特点进行调整。
洗涤次数和时间应根据具体情况进行优化。
第六步：二级抗体的添加和孵育二级抗体是与一级抗体（与目标蛋白质结合）结合的抗体。
一级抗体通常是与标记物结合的特异性抗体，而二级抗体则是对一级抗体产生反应的抗体。
二级抗体可以标记有荧光染料、酶或其他可视化标记物。
添加二级抗体的目的是通过放大信号来增强目标蛋白质的检测。
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一文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项、、、导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟:“想拿高分文章,不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话:“就是这个理,今天我就豁出去,将我十多年的心得与经验奉献给小师弟您了。
”小师弟感激涕零,唯诺细听两位前辈的教诲、、、、、、
免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry),就是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。
免疫组化主要用的就是组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片与组织芯片)与冰冻切片。
石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然就是首选的标本制作方法。
免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。
但就是却不知道如何正确地分析,得出理想的结果。
这实在就是一件憾事。
如下图,正常的结果应该就是这样的:镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色。
结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法与评分法。
前者就是在40*光镜下,随机10个视野下计数阳性着色细胞;后者则就是在光学显微镜下按染色程度(0分阴性着色,1分淡黄色,2分浅褐色,3分深褐色)与阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分
数相加。
免疫组化结果分析就是毛博的特长,以下就是她传授的独门
绝技。
1、对照染色
与做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立
对照染色。
没有对照染色的免疫组化结果就是不可信的。
对照一般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身对照。
一般来说,有一个阳性组织对照与一个阴性组织对照就足够了。
2、定位
抗原表达必须在特定部位。
如LCA应定位在细胞膜上;CK应定位在细胞浆内;PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。
不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。
有可能就是非特异性染色或者假阳性。
不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。
3、半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。
如果您的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。
因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。
免疫组化的半定量一般就分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。
以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光与亮绿色耀眼荧光。
弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。
至少随机观察5-10个HPF。
然后根据(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3计算出数值;总数值1、5者为(+++)。
4、图像分析仪
如果要进行精确定量的话,就要用到图像分析仪。
图像分析仪类型很多。
这里就不一一介绍了。
其实毛博最想隆重推荐的就是一款图像分析软件:Image J。
毛博当年在米国做博士猴的时候,就就是用的这款软件。
这就是NIH开发的免费软件。
一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。
现在已经开发到了1、50版。
网上可以免费下载。
其界面非常简洁,如下图所示。
现在,根据一个实例来瞧瞧如何用Image J来进行图像分析。
如下图所示,我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。
那么,如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先,要把彩色的图像转换成黑白图像。
步骤如下:Image→Type→16-bit。
转换成黑白图像后,将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤如
下:Image→Adjust→Threshold。
然后拖动鼠标,直到所有的细胞被标示出来。
有时候2个细胞靠得比较紧密,会被计数为1个细胞。
这个时候可以采用Image J的水洗功能。
步骤如下:Image→Binary→Watershed。
如下图的蓝色箭头所示,这些就是本来计数成一个的细胞,经过水洗之后,更加精确地被计数成了2个细胞。
然后,就可以正式开始分析了。
步骤如
下:Analyze→Analyze Particles。
在得出最后的结果之前,还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞,那么Size项里面选择“0-infinity”。
Circularity的默认值为“0、00-1、00”。
一般就取默认值。
最后的结果如下图所示。
软件自动测量了每个细胞的大小。
这里因为就是二维图像,所以就就是每个细胞的面积。
然后计数了一共有72个细胞,总面积为21286、00,平均大小为295、64。
免疫组化就是个苦活,时间长,步骤多,还要经常接触有毒致癌物质。
大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子,最后都希望得出自己想要的结果。
以上,毛博介绍了一些自己的心得体会。
希望广大的实验狗们都能做出自己想要的结果,早点发文章。
非特异性染色的八大原因然而,结果却未必都就是那么如意的,常常出现下面这种状况,好好的一张片子染得脏脏的,这就就是最常见的非特异性染色。
1、抗体问题,真的就是一分钱一分货啊！
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。
尤其就是背景非特异性染色不会太深。
真就是一分价钱一分货。
一抗过期也会造成杯具,所以要注意抗体的有效期。
2、抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也就是出现非特异性染色的常见原因。
解决的办法就就是预实验。
每次使用新抗体前应该多做预实验,摸索出最理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。
另一个常见原因就就是孵育时间过长。
解决的办法就就是定时器。
加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。
3、DAB染色时间太长/变质DAB的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。
DAB的显色时间不就是一成不变的,主要靠自己在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。
出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。
DAB要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入H2O2。
图1就冲洗的有些晚了;图2就就是刚刚好,染色效果棒棒哒!
4、内源性酶与生物素内源性酶与生物素也会造成非特异性染色,特别就是一些内源性酶生物素含量丰富的组织,如肝脏,肾脏,脾脏等。
处理的办法为:灭活碱性磷酸酶:最常用的方法就是将左旋咪唑(24 mg/mL)加入底物液中,并保持PH值在7、6-8、2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶;对于酸性磷酸酶,可以用50 mmol/L 的酒石酸抑制;对于内源性过氧化物酶,可以用0、9%的双氧水来灭活。
对于内源性生物素,染色前将切片浸于25 μg/mL 亲与素溶液中15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。
也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。
5、组织变干
一下子染太多片子的时候,容易出现这种情况。
解决的办法就就是不要贪多嚼不烂。
一次少染几张。
还有就就是试剂充分覆盖组织,超出组织边缘2 mm。
然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈,把修复液圈在里面。
避免修复液流走。
圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。
6、浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜,也会引起杯具。
这都就是偷懒的做法。
但就是有时候也就是可以偷一下懒的。
毛博的独门秘技就就是4°C冰箱。
只要把容器放在4°C冰箱里,过夜完全没有问题。
7、清洗不充分
清洗一定要充分。
PBS液一定要双蒸水新配,用之前再次测PH值。
缓冲液用0、05 mol/L的Tris-HCL,0、15 mol/L的NaCl即可。
如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。
8、封闭血清问题
就是否选择了正确的封闭血清。
原则就是选择二抗动物的非免疫血清,例如二抗就是羊抗兔,就要选择非免疫羊血清。
用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分钟。
这里不用洗,直接甩掉即可。
毛博再贡献一个独门绝招,直接用奶粉也可以。
用5%的脱脂奶粉就可以了。
而且效果还不错。
怎么样？简单吧。
师傅领进门,造化瞧个人了。