碱性磷酸单醋酶在DNA体外重组试验中的应用
重组DNA技术的发展与应用
重组DNA技术的发展与应用DNA是生命的基础物质，是组成细胞和基因的重要成分。
DNA重组技术，即重组DNA技术，是一种利用人工手段操作和改变生物DNA序列的技术。
它在现代生物科技中很重要，可以用于生物制药、基因工程、遗传工程、育种改良等方面。
本文将从重组DNA技术的起源和发展入手，探讨其目前已有的应用和未来的发展趋势。
一、起源与发展重组DNA技术的发展起源于20世纪60年代，当时研究人员通过技术手段将细菌DNA序列进行了改变。
50年来，这项技术得到了极大的发展。
最早的技术是将外源DNA片段与细胞质体融合，产生了质粒；接着，科学家又发现了限制性内切酶、DNA连接酶等，这些工具让重组DNA技术更加完善；再之后，PCR技术的发明，更让重组DNA技术的上限大大扩大。
以上种种，皆为了更精准多样的重组DNA，进而具有更多应用价值。
二、重组DNA技术的应用1、生物制药生物制药即以重组DNA技术为基础，通过改变人类基因序列，来创造新型药物。
这些以基因重组为基础的药物早在20世纪90年代就已经投入市场了。
例如，利用重组DNA技术，人类可以利用大肠杆菌细胞表达重组蛋白，来生产人类生长激素、抗体等药物，用于治疗糖尿病、失明、免疫系统疾病等多种疾病。
这些以基因重组为基础的药物，不仅疗效更加明显，而且相对更加安全。
2、基因工程基因工程常用于为目标生物植入外源DNA片段，进而改变其形态、特性、乃至其运作方式。
常见的应用包括：将人类荧光基因植入白地鼠的基因中，从而使其身体部位（例如耳朵、尾巴）发出绿色荧光；将水稻植入Bt基因，让其长成可以自我保护的Bt水稻。
3、遗传工程遗传工程是通过重组DNA技术改变生物个体遗传信息，达到对目标个体进行改进或优化的一种工程技术。
常见的应用包括：将鱼的基因植入番茄中，从而让其耐旱、耐盐、耐寒，更加适应恶劣环境；将鸡（或其他鸟类）的生长因子基因注入到其他家禽中，从而让其生长速度加快。
4、育种改良重组DNA技术还广泛应用于动植物育种改良方面，重组DNA技术能够提高育种效率，降低育种成本。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
重组DNA技术是一种基因工程技术，通过改变DNA序列来创建新的DNA序列或改变现有DNA序列。
它可以用于插入外源基因、删除或替换特定基因、改变基因的表达水平等。
重组DNA技术的基本原理是利用酶切和连接作用来剪切和连接DNA分子。
首先，通过特定的限制性内切酶将DNA分子切割成特定的片段。
然后，通过DNA连接酶将所需的DNA 片段连接起来，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
操作方法包括以下几个步骤：1. 提取目标DNA：从源细胞或组织中提取目标DNA，可通过酸性条件、酶处理和离心等方法获得。
2. DNA片段的切割：使用限制性内切酶选择性地切割目标DNA和外源DNA，生成互补的黏性末端或平滑末端。
3. DNA片段的连接：通过DNA连接酶将切割的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
4. 重组DNA的导入：将重组DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化、病毒转染等。
5. 重组DNA的复制和表达：在宿主细胞中，重组DNA可以经过复制和转录/翻译过程，产生相应的蛋白质。
重组DNA技术的应用十分广泛，包括：1. 生产重组蛋白质：通过插入外源基因，改变宿主细胞的代谢途径，使其表达目标蛋白质，用于药物生产、工业生产等。
2. 基因治疗：将健康的基因插入患者的细胞中，用于治疗遗传性疾病等。
3. 基因敲除和敲入：通过重组DNA技术，在宿主细胞中删除或替换特定基因，研究基因功能和相关疾病的发生机制。
4. 基因工程作物：通过插入外源基因，改变植物的性状，使其具有抗虫、抗病、抗逆境等特性。
5. DNA检测和诊断：包括PCR扩增、基因测序、基因突变检测等，用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪学等领域。
总之，重组DNA技术的原理是通过酶切和连接作用来改变DNA序列，操作方法包括提取DNA、切割DNA片段、连接DNA片段、导入宿主细胞并实现复制和表达。
其应用领域广泛，包括蛋白质生产、基因治疗、基因工程作物等。
DNA重组技术在生物工程中的应用
DNA重组技术在生物工程中的应用DNA重组技术是一种使两段不同的DNA序列连接起来的方法，其应用可以扩大DNA的序列范围，实现特定DNA序列的合成。
DNA重组技术是现代生物工程的重要工具，在人类医学、环境保护、农业生产等领域都有广泛的应用。
一、基本概念DNA重组技术包括DNA插入、DNA外切重接和酶解部分连接等多个步骤，其中最核心的过程是DNA插入。
DNA插入的过程中，需要利用一种DNA酶活性来切断DNA链，并利用另外一种酶活性将外切的两部分DNA链切口粘接，从而实现形成合成DNA序列的目的。
二、应用领域DNA重组技术在生物工程领域中具有广泛的应用。
以下是一些典型的应用领域：1. 基因工程：基因工程旨在开发新的生物学性状，例如新的蛋白质表达、新的医疗治疗方法等。
基因工程通常涉及到对目标基因进行克隆、插入、修饰和表达等过程。
DNA重组技术可以方便的实现这些目的，从而达到制备需要的生物产品的目的。
2. 农业领域：在农业育种领域，基因重组技术被广泛应用于作物遗传资源的导入、转导、重组和表达等方面。
例如，一些植物和畜禽的基因被移植到其他物种中去进行改良，从而实现目标性状的改良。
此外，DNA重组技术还可以帮助人们明确确定选育新品种的性状和基因组预测，提高作物产量。
3. 药物研发：药物研发领域中，DNA重组技术是一个关键的研究工具。
该技术可以用来开发新药物、诊断工具和疫苗，为医学治疗提供了新的可能性。
与传统的药物研发方法相比，基因工程技术可以更加精准和有效的识别和研发需要的目标分子，以完成药物的创新研发。
4. 环境保护：DNA重组技术在环境保护方面的应用也越来越重要。
例如，它可以用于恢复破坏的环境、对污染物进行测定，并研究受阻碍的生物反应序列。
此外，DNA重组技术本身也是一种环境友好型的技术，可以有效的减少环境污染。
三、发展前景随着现代生物学的发展，我们可以预测DNA重组技术应用领域还将不断扩大。
未来，我们期望DNA重组技术在医学、环境保护、食品生产、能源等更多领域中发挥更加重要的作用。
重组酶原理
重组酶原理
重组酶是一类能够识别特定DNA序列并将其重新组合的酶。
它们通过结合到DNA的两个断裂端，切割和重新连接DNA 链来完成DNA的重组。
重组酶的基本工作机制如下：首先，重组酶会识别并结合到DNA的两个断裂端。
然后，它们通过切割一条DNA链，形成一个单链断裂。
接下来，重组酶会与另一个DNA分子的单链断裂进行配对，并利用配对的分子作为模板来合成新的DNA 链。
最后，它们会断开配对的分子，并将重组的DNA链重新连接在一起。
在DNA重组的过程中，重组酶还能够调控切割位点的选择。
它们可以识别特定的DNA序列，这些序列通常是典型的反向重复序列或共有的序列。
通过识别这些特定的序列，重组酶能够准确地切割DNA并重新组合。
重组酶在很多生物学过程中都起着重要的作用，例如DNA修复、免疫系统的适应性免疫和基因组重组。
了解重组酶的原理不仅可以帮助我们理解这些生物学过程的机制，还有助于开发新的基因工程技术和治疗方法。
碱性磷酸酶的酶学性质研究及其在心肌标志物免疫检测中的应用
碱性磷酸酶的酶学性质研究及其在心肌标志物免疫检测中的应用刘秀菊【摘要】目的研究不同缓冲溶液和添加剂(如NaN3和不同分子量的聚乙二醇)对碱性磷酸酶活性和稳定性的影响,并建立了心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和C-反应蛋白(CRP))的酶联免疫检测体系.方法碱性磷酸酶的活性通常是用分光光度计法检测产物的生成量来计算.棋牌法建立cTnⅠ和CRP的酶联免疫检测体系.结果缓冲溶液的种类、浓度和pH对酶反应产物的摩尔吸光系数和酶促反应速度有不同程度的影响.反应体系中加入NaN3(5～30 mM)和各种分子量的PEG(100 mg/ml)对酶活性没有显著影响,但不同分子量的聚乙二醇对酶均有一定的稳定化作用.结论二乙醇胺(DEA)缓冲液对碱性磷酸酶有激活作用,NaN3和PEG对碱性磷酸酶没有显著影响.两种体系的检测性能良好,为该类试剂盒的开发提供有价值的信息.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2018(026)009【总页数】5页(P12-16)【关键词】碱性磷酸酶;心肌肌钙蛋白Ⅰ;C-反应蛋白;酶联免疫吸附反应【作者】刘秀菊【作者单位】广东省深圳市龙岗区妇幼保健院检验科,广东深圳518000【正文语种】中文【中图分类】Q556碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一种水解酶，在碱性环境中能水解很多磷酸单酯化合物。
该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，也经常用于在酶联免疫吸附反应（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）中标记抗体或抗原，进而帮助检测相应的抗原或抗体的含量。
碱性磷酸酶的酶学性质已经得到广泛研究，如从不同物种中提取此酶，研究它的Km和Vmax值、最适pH和最适反应温度等基本性质，从而比较不同物种之间碱性磷酸酶的差异[1-3]。
但是对碱性磷酸酶活性的其他影响因素（如缓冲液、NaN3、聚乙二醇等）研究较少。
另外，这些实验多采用分光光度法跟踪碱性磷酸酶催化对硝基苯酚磷酸盐在水溶液中水解生成对硝基苯酚的反应，都是基于产物在水溶液中的摩尔吸光系数不变的情况下来测定酶的活性。
《2024年利用重组蛋白技术提高PfuDNA聚合酶体外活性的研究》范文
《利用重组蛋白技术提高Pfu DNA聚合酶体外活性的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，DNA聚合酶作为分子生物学研究中的关键酶类，其性能的优化和改良日益受到关注。
Pfu DNA聚合酶作为常用的一种高效、高保真的酶类，被广泛应用于DNA 序列分析、克隆以及PCR反应等多个领域。
然而，由于实验条件和应用需求的不同，其体外活性常常面临一定的挑战。
因此，本研究旨在利用重组蛋白技术提高Pfu DNA聚合酶的体外活性，以期为相关领域的研究和应用提供更高效、更稳定的酶源。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料包括Pfu DNA聚合酶基因、表达载体、大肠杆菌宿主菌等。
实验中所需的各种化学试剂和耗材均为市售优质产品。
2. 方法（1）基因克隆与表达：根据Pfu DNA聚合酶的基因序列设计引物，通过PCR技术扩增目标基因片段，将其克隆至表达载体中。
然后转化至大肠杆菌中，进行诱导表达。
（2）重组蛋白的纯化与鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对重组蛋白进行纯化。
纯化后的蛋白通过SDS-PAGE和Western Blot等方法进行鉴定和浓度测定。
（3）体外活性检测：将纯化后的Pfu DNA聚合酶与模板DNA、引物等反应物混合，进行PCR反应。
通过测定反应产物量、反应速率等指标，评估Pfu DNA聚合酶的体外活性。
（4）活性优化：针对Pfu DNA聚合酶的活性特点，通过改变反应条件、添加辅助因子等方法，优化其体外活性。
三、实验结果1. 重组蛋白的表达与纯化通过基因克隆与表达，成功获得了Pfu DNA聚合酶的重组蛋白。
经过亲和层析和离子交换层析等纯化步骤，得到了纯度较高的Pfu DNA聚合酶重组蛋白。
SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果表明，纯化后的蛋白具有较高的纯度和特异性。
2. 体外活性检测将纯化后的Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，通过测定反应产物量、反应速率等指标，发现其体外活性得到了显著提高。
高三生物一轮复习课件：第41讲 基因工程
制的技术。
②PCR的条件： 目的基因DNA(模板)、四种游离的脱氧核苷酸、
耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反 应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性） 控制温度变化
）。 5’
3’
3’
5’
第一轮循环的产物
第二轮循环的产物
第三轮的产物
一、目的基因的筛选与获取
思考 获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 至少要三次循环。
3’
第二一 三次循环 3’
5’
53’ ’
3’ 5’
5’
第一轮产生的子链长度小于模板链长度，到第三轮循环 时，才出现2个两条脱氧核苷酸链等于目的基因。
第41讲 基因工程
主要考点 必备知识
考点一 重组DNA技术的基本工具 考点二 基因工程的基本操作程序 考点三 实验：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电
泳鉴定 考点四 基因工程的应用和蛋白质工程
考点一 重组DNA技术的基本工具
一、基因工程
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物 ，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物
条件：基因比较小， 核苷酸序列 已知 方法：通过_D_N_A_合__成__仪___用化学方法直接
⑵从_基__因__文__库__中获取
人工合成
从_基__因__组_CR技术扩增目的基因
一、目的基因的筛选与获取 3.获取目的基因的方法
⑶利用PCR技术扩增目的基因 ①概念：PCR是___聚__合__酶__链__式__反__应_的缩写，它是一项根据
碱性磷酸酶生化实验报告
一、实验目的1. 熟悉碱性磷酸酶（ALP）的生化特性；2. 掌握ALP的分离纯化方法；3. 学习ALP比活性测定和动力学分析；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有磷酸基团转移活性，在碱性条件下能水解多种磷酸单酯化合物。
ALP在生物体内具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏解毒、钙磷代谢等过程。
本实验旨在通过分离纯化ALP，测定其比活性和动力学参数，为进一步研究ALP的生物学功能提供实验基础。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：兔肝匀浆液、正丁醇、丙酮、乙醇、NaCl、MgCl2、MnCl2、磷酸苯二钠、4-氨基安替比林、铁氰化钾、pH缓冲液等。
2. 实验仪器：恒温水浴箱、离心机、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. ALP的分离纯化（1）将兔肝匀浆液与等体积的正丁醇混合，充分振荡，静置，取上层滤液。
（2）向滤液中加入1/10体积的MgCl2、MnCl2溶液，混匀。
（3）加入等体积的丙酮或乙醇，静置，离心（3000r/min，10min），取沉淀。
（4）沉淀用少量pH7.0的磷酸缓冲液溶解，再次离心，取上清液。
2. ALP比活性测定采用磷酸苯二钠为底物，在pH10的碳酸缓冲液中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌类衍生物，通过测定吸光度变化计算ALP的比活性。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，测定不同底物浓度下的酶活性，计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果1. ALP的分离纯化通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取纯化ALP。
SDS-PAGE结果显示，纯化后的ALP蛋白呈单一条带。
2. ALP比活性测定通过测定不同底物浓度下的酶活性，计算出ALP的比活性为1.5U/mg。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算出ALP的米氏常数（Km）为0.01mmol/L，最大反应速度（Vmax）为200U/min。
基因工程(DNA重组技术)
基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通 过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物 以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需 要的新的生物类型和生物产品。
体外
体内
DNA
重组DNA
受体细胞
剪切、拼接
扩增、表达
获得新性状
原理 操作对象 操作水平 目的 结果
基因重组 基因
ＤＮＡ分子水平 定向地改造生物的遗传性状 人类需要的生物类型和生物产品
1
基本工具
2
操作步骤
3
应用
4
蛋白质工程
1
基本工具
基因工程的基本工具
基因工程的“基本工具”
分子手术刀——限制性核酸内切酶 分子缝合针——DNA连接酶 分子运输车——基因进入受体细胞的载体
注意： 工具 工具酶 3种 2种
细胞内
酶 耐高温的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶
1
PCR中不需要： 解旋酶 限制酶 DNA连接酶
2
PCR呈指数扩增， 约为2n,n为循环 次数。
3
引物有两种，复 制方向是沿子链 5， 3，
75
例题 如图所示利用PCR技术扩增目的基因，图中引物为单
链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下叙述错误
C
G
A
T
A
T
C
G
G
C
A
T
3,
G
C
5,
（1）一个图甲所示的质粒分子经Sma Ⅰ 切割前后，分别含有 0 、 2 个游离 的磷酸基团。
（2）若对图中质粒进行改造，插入的 SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性 越高 。
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能 使用Sma Ⅰ切割，原因 是SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基 。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
山东大学实验报告 2013年 10 月 22日至11月19日姓名系年级 2011级生技一班学号 201100140112 组别四题目DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定同组者一、【实验目的】1.学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。
2.掌握对DNA进行限制性内切酶酶切的实验技术。
3.学习和掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术。
4.学习和掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理与方法。
5.学习和掌握热激法转化E.coli感受态细胞的原理与方法。
6.掌握α-互补筛选法的原理。
7.学习用试剂盒提取质粒DNA的方法。
8.复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
9.学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
二、【实验原理】通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。
核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。
另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。
重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
1．限制性核酸内切酶（1）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
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遗传ＨＦＲＦＤＦｒＡＳ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） ７ （３）： １５－１７ １９８５碱性磷酸单醋酶在ＤＮＡ体外重组试验中的应用刘传暄马清钧苏国富（军事医学科学院基础医学研究所，北京）
在遗传工程中，目的基因与载体ＤＮＡ进行连接反应时，为确保这些ＤＮＡ与载体重组成功，通常需加人数倍于目的基因的载体ＤＮＡ，但是，大量加人载体ＤＮＡ，由于连接反应使大多数ＤＮＡ分子自身环化［［３１，在转化时产生大量不含目的基因的转化子，而含重组ＤＮＡ的转化子则很少，需筛选大量菌落，才能得到含有重组ＤＮＡ的转化子，这样，载体的自身环化给筛选工作带来很大的工作量。Ｕｌｌｉｃｈ等１４１介绍了一种减少载体ＤＮＡ自身环化的简单方法，就是用碱性磷酸单醋酶切除掉载体ＤＮＡ ５’末端的磷酸基１５１，然后再进行体外重组。经这样处理后的载体分子，由于缺少连接酶作用的底物（５’磷酸基），分子之间不能相互连接，但其３‘末端的经基可与未脱磷的外源ＤＮＡ连接成缺口环状型的重组ＤＮＡ分子。采用这种方法可以大大减少筛选时的工作量，所以碱性磷酸单醋酶在ＤＮＡ体外重组中的应用日趋广泛。我们选用质粒四Ｒ３２５为模式，用细菌碱性磷酸单醋酶处理后，转化Ｅｃｏｌｉ ＲＲＩ，获得了较为满意的结果。我们采用此法顺利地完成了国内乙型肝炎病毒基因组与ｐＢＲ３２５的重组工作。材料和方法材料ＥｃｏＲＩ （５，０００Ｕ／ｍｌ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ）；细菌碱性磷酸单醋酶（简称ＢＡＰ， ２， ５０ＯＵ八２１ｚ１，ＢＢＬ， ＩＮＣ．）； Ｔ４－ＤＮＡ连接酶（ＩＯＯＵ／５０，ｕ１，ＢＲＬ ＩＮＣ．）； ｐＢＲ３２５，酸酚法纯化，２００ｎｇ／ｐｌ，含微量ＲＮＡ； ＨＢＶ ＤＮＡ，从乙型肝炎病毒携带者血清中按Ｌａｎｄｅｒｓ法纯化；Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ，培养于ＬＢ培养基。方法ｐＢＲ３２ ５的ＥｃｏＲＩ酶解５０ｆｚｌ反应液中含ｐＢＲ３２５ ５ｆｚｇ， Ｅｃｏ ＲＩ ２５Ｕ，反应缓冲液为１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．８，ＩＯＭＭ ＭｇＣＩ １ＭＭＤＴＴ， ３７℃水浴反应１小时，６５℃灭活５分
钟，取样于水平板式琼脂糖凝胶上电泳检查达完全酶解后供下一步用。反应产物标为ｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ．ｐＢＲ３２５－Ｅｃｏ ＲＩ片段的碱性磷酸单醋酶（ＢＡＰ）处理５０ｐ１反应液中含２Ｆｚｇ ｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ， １２Ｕ细菌碱性磷酸单醋酶，反应液为２５一１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ ｐＨ８．０＇３，＇ｌ０ ６５℃水浴反应１小时，随后加人用５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ声８．０饱和的酚５０川，旋涡振荡器上振荡数次，高速台式离心机上离心２分钟后，吸出酚液。吸出的酚液中加人５０ ｊｚＩ ＩＯｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｔ ｐＨ８．０缓冲液，同上法处理后，吸除酚液。将两次抽提得到的水相合并，加进５倍体积的用灭菌蒸馏水饱和的乙醚，混匀，简短离心，吸出醚液，反复抽３－４次，然后在所获水相中加２Ｍ ＮａＡｃ ｐＨ５．０至最终浓度为２５０ｍＭ，再加人２体积冷的无水乙醇，置低温冰箱４小时后再在液氮中冻，至１０分钟，低温条件下用台式高速离心机离心１５分钟，弃上清，然后用Ｉ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ， ｌ ｍ ＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５缓冲液配制的冷７０多乙醇洗一次，最后用ＩＯｐＩ ＩＯｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ ｐＨ７．５缓冲液溶解沉淀物。样品标为ｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ－ＩＢＡＰｏ
Ｌｕ Ｃｈｕａｎｘｕａｎ ｃｔ ａｌ．： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａ－ｌｉｎｅ Ｐｈ０Ｓｐｈａｔａｓｅ （ＢＡＰ） ｔｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｍｂｉ－ｎａｔｔｏｎ
．１５．ＤＮＡ的连接脱磷及未脱磷的线性ｐＢＲ３２５在５０ｊｚ１反应体积中进行连接。反应液含１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ ｐＨ７．６， ＩＯＭ Ｍ ＭｇＣ１Ｚ，１ｍＭ ＡＴＰ， ｌＯｍＭ ＤＴＴ， ４Ｕ Ｔ４ＤＮＡ连接酶
（未脱磷者为３Ｕ），于低温水浴槽中１２℃连接过夜。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ的转化基本按Ｃｏｈｅｎ方法进行。用含Ａｐ，Ｔ。分别为２ ５１ｔｇ／ ｍｌ及２０１Ａｇ／ｍｌ的选择培养基平板筛选转化子，２４至３６小时内记录结果。结果及讨论我们采用ｐＢＲ３２５－Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ作为载体－宿主模式系统，观察了细菌碱性磷酸单醋酶处理前后的质粒载体对ＲＲＩ的转化效果。随后应用这一方法进行乙型肝炎病毒基因组的克隆试验。ＢＡＰ对于质粒转化率的影响见表１。在本裹１ ＢＡＰ处理前后不同ＤＮＡ样品对ＲＲＩ的转化效果实验室条件下，酸酚纯化后的质粒ｐＢＲ３２５ＤＮＡ对Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ的转化率一般都大于１０５／ ｌａｇＤＮＡ。经Ｅｃｏ ＲＩ酶切后的线性质粒ＤＮＡ对ＲＲＩ的转化率为５．２０Ｘ １０＇／Ｍ ＤＮＡ，较超螺旋型ｐＢＲ３２５的转化率锐减约两个数量级。这种线性ＤＮＡ经连接酶作用后转化率可提高至５．７５ Ｘ １０＇／Ｉｚｇ ＤＮＡ，但仍较超螺旋型质粒的低数倍。而脱磷后的线性ｐＢＲ３２５ ＤＮＡ对ＲＲＩ的转化率只有５．７１ Ｘ １０＇／ｌｚｇ ＤＮＡ，经连接酶连接后转化率可达１．１８ Ｘ １０＇／ ＩＡｇ ＤＮＡ，但与未脱磷线性ｐＢＲ３２，的连接产物的转化率相比要低得多，前者约是后者的１／５。线性ＤＮＡ脱磷后仍对ＲＲＩ具有微弱转化能力，这是因为在我们所应用的条件下，ＤＮＡ的脱磷是不完全的，相当一部分未脱磷的线性ＤＮＡ仍可转化ＲＲＩ，而且经连接酶作用后这种转化能力还能上升一定的幅度。从表１可见，经ＢＡＰ脱磷后的质粒ｐＢＲ３２ ５ＤＮＡ在连接酶处理前后所产生的转化率都较相应未脱磷样品大幅度减少（连接前后分别相当于同样情形下未脱磷者转化率的１０形及２０多），这种减少表明ＢＡＰ的应用有效地阻止了载体线性ＤＮＡ分子的自身环化，这就可以减小筛选工作量数倍以至十倍。对于ＢＡＰ的脱磷效果，可以用电泳的方法检查，取ＢＡＰ处理过的样品用连接酶连接后，比较连接前后的样品的电泳图谱，如无线性ＤＮＡ以外的电泳带，则表明脱磷完全。但必须是在ＢＡＰ完全脱磷条件下才可采用这一方法。在不完全脱磷时，由于未脱磷线性ＤＮＡ可以连接起来，电泳图谱较复杂，难于从数量上观察脱磷效果。采用转化的方法则可克服这一点，脱磷ＤＮＡ连接前后与同情形未脱磷样品的转化情况相比，从转化子数目的产生情况就可直接观察到ＢＡＰ的作用效果。我们采用后一方法得到较满意结果，而采用前一方法则不易得出确切结论（资料未示）。１００％的脱除ＤＮＡ上的５Ｆ磷，似乎是理想的，但在重组试验中这是不必要的Ｅｌｌ，亦未必有利于试验，因为ＤＮＡ完全脱磷要耗费大量的ＢＡＰ，由于酶的质量问题，在用大量ＢＡＰ处理ＤＮＡ时，可能会产生不良作用；再者，在反应后的酚抽提中难于将此酶去除千净，因而影响下一步实验。当然，载体ＤＮＡ上的磷脱除得越多，筛选工作量就越小。按我们试验采用的载体ＤＮＡ的脱磷程度是适宜的，已成功地应用于国内乙型肝炎病毒ＤＮＡ （ａｄｗ亚型）与ｐＢＲ３２５的重组工作上。在建立国内ａｄｗ亚型的乙型肝炎病毒基因组分子无性繁殖系的工作中，用和不用ＢＡＰ处理载体进行体外重组的结果如下。在不用ＢＡＰ处理技术的试验中，ＨＢＶ ＤＮＡ和ｐＢＲ ３２ ５以１：２的比例混合用ＥｃｏＲＩ切开后进行重组，得到的结果是：以ｐＢＲ ３２ ５ ＤＮＡ计算的转化率为７．５ Ｘ １００／ ｆａｇ ＤＮＡ。在插人灭活试验中，
ＤＮＡ样品转化率（转化子数／，ｕｇＤＮＡ二
ｐＢＲ３２５ｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲｌｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ－ＢＡＰｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ一ｌｉｇｐＢＲ３２５－ＥｃｏＲＩ一ＢＡＰ一ｌｉｇ１．８９ｘ１０＇５．２０ｘ１沪５．７１Ｘ１护５．７５Ｘ１０４Ｉ．１８Ｘ１０４
１６Ａｐ＇Ｔｃｒ Ｃｍ－菌株的出现率为１．０４多，所得插人灭活转化子经快速抽提质粒检查后，发现它们所含质粒均与ｐＢＲ３２５等大，有的甚至略小。后来改用ＢＡＰ处理的ｐＢＲ ３２ ５与ＨＢＶ ＤＮＡ重组，ＨＢＶ和ｐＢＲ３２５以１：７．７比例混合，所得转化率为１．２５ Ｘ １０＇／Ｉｚｇ ＤＮＡ。全部转化子经插人灭活检查后得到２４５个Ａｐ｀ Ｔｃｒ Ｃｍ一表型的菌株，占全部转化子的２．８多。２４５个Ａｐｒ Ｔｃｒ Ｃｍ－菌株用快速抽提法抽提质粒，凝胶电泳检查发现有８３个菌株含有大于ｐＢＲ３２５ ＤＮＡ的重组质粒带，限制内切酶分析及分子杂交试验表明，这些重组质粒中含有ＨＢＶ ＤＮＡ，从其中选出的含全长ＨＢＶ ＤＮＡ的重组质粒之代表性结果见图１０上述资料表明，ＢＡＰ技术实际应用的结果和模式试验的结果是相一致的。用和不用ＢＡＰ，体外重组工作的效率有很大差别，载体ＤＮＡ脱除５１磷后，其相对于外源ＤＮＡ的用量比例可明显增大，而由于载体自身环化现象的大大减少，筛选工作量则可较大幅度地减小，从本文实际应用的经验来看，可以减少５倍左右，很便利于重组工作的完成。
主要参考文献
图１采ＹＥ ＢＡＰ技术，用全长ＨＢＶ （ａｄｗ） ＤＮＡ与ｐＢＲ３２５相连接获得的重组质粒ｐＭＭ－ＨＢＶ（１） ｐＢＲ３２５； （２） ｐＭＭ－ＨＢＶ； （３） Ｘ＋ＥｃｏＲＩ；（４） ｐＭＭ－ＨＢＶ＋ＥｃｏＲＩ； （５） ＨＢＶ线性ＤＮＡ，由ｐＡＯｌ－ＨＢＶ＋ＥｃｏＲＩ切后电泳纯化得到；（６）ｐＢＲ３２５＋ＥｃｏＲＩ．
［１］Ｂｏｌｉｖａｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．： １９７９． Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌａ－ｇｙ， Ｖｏｌ． ６８： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｙ Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．２５８，［２］Ｄｕｂｏｉｓ， Ｍ． Ｆ． ｅｔ ａ％．； １９８０． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ７７： ４５４９－４５５３．〔３１ Ｍｏｒｒｏｗ， Ｊ． Ｆ．： １９７９． Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ６８： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＲａｙＷｕ，人ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． ３一２４．［４ ］ Ｕｌｌｉｃｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ．： １９７７． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９６；１３１９，［５］Ｗｅｉｓｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．： １９６８一ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３：４５３０－４５４２．
会讯全国小麦杂种优势利用研究学术讨论会纪要
全国小麦杂种优势利用研究学术讨论会于２月２５日至３月２日在京召开，２８个单位、５７名代表参加了会议。会议收到学术论文１７篇，研究年度报告１７篇，共计３４份材料，宣读了１３篇学术论文。这次会议交换的论文，在深度和广度上都反映出我国小麦杂种优势利用研究工作的新水平和新高度。在广度上，从农艺性状到品质性状，从高产半矮秆杂种小麦的培育到杂种小麦最适宜密度的研究，从化学杀雄到新三系选育；在深度上，从地下部根系测定到地上部花药显微观察，从育性恢复的遗传研究到育性恢复的基因型与环境互作，从同工酶预测杂种优势到配合力分析、亲子相关和遗传距离测定等等。年度工作总结细致认真，既有可供各单位借鉴的经验，又有可吸取的教训。山东农业大学认真总结了十几年选育恢复系的经验，仔细分析了选育恢复系四种方法的利弊，统计了不同方法选育出优良恢复系的机率，认为品种ｘ恢复系的方法易选出优良的恢复系。黑龙江克山农科所总结了十几年春麦区配制杂种组合的经验，认为杂种优势利用研究工作应与常规育种相结合，培育杂交小麦应分几步走的策略。河北草城农科所介绍了制种推广环节对杂交小麦在生产上大面积应用的重要性。与会代表还抓住目前研究工作存在的主要问题进行了充分的讨论，认为今后应做好以下几项工作：①对连续几年表现优良的强优势杂种组合，要加快对其亲本材料的繁殖、制种，为杂交小麦在生产上示范推广做好准备，使已有的强优势杂种组合尽快取得增产效果。同时，注意继续提高三系的水平，大量配制各种类型的杂种组合，以满足高产、中产、低产、旱地和盐碱地的需要。⑧继续坚持开放育种的方针，进一步加强协作，及时交换材料和信息，做到“统一分工，各有侧重，集体协作、尽快突破”。⑧优质应作为杂交小麦的重要育种目标之一。④在坚持以下型不育系为主攻方向的同时，可开展化学杀雄、新三系选育等多种途径的研究。（北农大王明理）