荧光分光光度法
实验四 荧光分光光度法测定维生素 B2
实验四荧光分光光度法测定维生素B2一、实验目的1．了解F 96 荧光分光光度计的性能及操作。
2．掌握荧光分析法的基本原理。
3．学习荧光分析法测定维生素B2 的含量。
二、实验原理维生素B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。
其水溶液在pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为λex= 465 nm ，最大发射波长为λem = 520 nm。
在低浓度时，λex = 465 nm 时在520 nm 处测得的荧光强度与维生素B2 成正比。
即：I F＝Kc采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素B2 含量。
当pH 在11以上时，荧光猝灭。
图 4 维生素B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）三、仪器与试剂1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。
2．试剂：1％HAc 溶液；维生素B2；复合维生素片剂。
四、实验步骤1．维生素B2 标准溶液的配制称取10.0 mg 维生素B2，先溶解于少量1％HAc中，然后转移至 1 000 mL容量瓶中，用1％HAc稀释至刻度，摇匀，即配制成10.0 μg/mL的维生素B2 标准溶液。
溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。
2．标准系列溶液的配制取5个50 mL的容量瓶，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，待测。
3．未知样品溶液的配制取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以1％HAc溶解，转移至50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。
4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于F96 荧光分光光度计上，选择合适的激发波长和测定波长，测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素B2 的含量。
五、数据处理1．由记录仪记录所得荧光光谱图上查出标准系列不同浓度维生素B2 相应的荧光强度，作工作曲线。
2．在荧光光谱图上查出未知样品的荧光强度，在工作曲线上查出对应浓度，进行换算后求出片剂中维生素B2 的含量。
2020版《中国药典》荧光分光光度法检验操作规程
一、目的：二、范围：本操作规程适用于荧光分光光度法的检验操作。
三、职责：1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。
四、内容：1、对仪器的一般要求：1.1所用仪器为荧光计或荧光分光光度计，荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190～650nm，发射波长扫描范围是200～800nm。
可用于液体、固体样品(如凝胶条)的光谱扫描。
1.2仪器基本组成：1.2.1光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
1.2.2激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
1.2.3发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
1.2.4样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
1.2.5检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
2、基本原理：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。
物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用于该物质的定性分析。
当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用于该物质的含量测定。
荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高，但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象，而且在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。
3、测定法：3.1所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。
3.2通常荧光分光光度法是在一定条件下，测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。
荧光分光光度法
荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法测定硒实验流程
荧光分光光度法测定硒实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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荧光分光光度法测定维生素B2含量
一、实验目的1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计基本原理、结构及性能，掌握基本操作。
二、实验原理维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。
其分子式为：C17H20N4O6，分子量：376.4。
VB2分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。
VB2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
VB2溶液在430～440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。
VB2在pH＝6～7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与VB2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测VB2的含量。
VB2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比VB2的荧光强得多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度F与荧光物质浓度c 呈线性关系：F=Kc，这是荧光光谱法定量分析的依据。
注意：高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系。
三、主要仪器与试剂主要仪器：荧光分光光度计；1cm石英皿；25mL比色管；1mL、5mL移液管试剂：VB2标准溶液5.0μg/mL；待测样品溶液四、实验步骤1、系列标准溶液的制备取VB2标准溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 分别置于25mL比色管中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
得浓度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、0.50μg/mL 的一系列VB2标准溶液。
待测。
2、激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置λem＝540nm为发射波长，在250～500nm范围内扫描，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。
从激发光谱图上可找出其最大激发波长λex。
从得到的激发光谱中找出最大激发波长，在此激发波长下，在450～700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。
荧光分光光度法测定维生素B2
S1
S2 T1
S0 吸光1 吸光2 荧光3
荧光、磷光 能级图
固定第二片滤光片λ（nm）： 第一片滤光片 （兰字）λ（nm） Fs F0 Fs-F0
第二片滤光片λ 420 （nm） Fs F0 Fs-F0
360
400
480
530
固定第一片滤光片λ（nm）： 450 470 510 550 600
实验内容
• 1. 标准曲线的制作 • 维生素B2系列标准液的配制：操作规范 • 灵敏度选择：（旧仪器统一选10，新仪器 选4） • 滤光片的选择：Fs-F0最大 • 标准曲线的绘制： c 对 Fs- F0作图，线性 • 2. 样品含量的测定 • 样品溶液的制备（称量，定容，样品处理， 最后定容） • 管的全称是“分度吸量管”，它 是带有分度的量出式量器（带刻度的 移液管。
• 吸量管的使用方法与移液管大致相同。
实验注意事项
基本操作要规范： 吸量管的使用，溶液转移，定容 试剂取后，得放回原处 保持试验台整洁
实验报告格式
1、实验目的（简单） 2、实验原理（详细） 3、试剂仪器（简单） 4、实验步骤（简单） 5、数据处理（详细，表格，图） 6、结果讨论（重点） ①、回答思考题的问题 ②、讨论引入误差的原因 ③、实验操作中的注意事项及减小误差的方法
标准曲线法
荧光强度 vs.浓度标准曲线
荧光强度
样本
核黄素浓度
Fs- F0最大
最大的激发波长 最大的发射波长
激发 滤光片 发射滤光片
荧光发射 处于第一激发单重态 中的电子跃回至基态各振动 能级时，将得到最大波长为 λ 3的荧光。很明显，λ 3的 波长较激发波长λ 1或λ 2都 长，而且不论电子开始被激 发至什么高能级，最终将只 发射出波长λ 3为的荧光。 荧光的产生在10-7-10-9s内 完成。
荧光分光光度法测定维生素B2的含量
荧光分光光度法测定维生素B2的含量实验项目：荧光法定量测定维生素B2的含量实验目的：1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理含有荧光基团的化学物质维生素B2，在吸收光能而被激发以后发射荧光，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。
溶液中维生素B2被入射光（I0）激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度（I f）。
在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。
标准曲线法是取一定已知量的维生素B2的对照品与待分析试样溶液经过相同的处理后，将对照品配制成一系列浓度的对照溶液，测定其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以对照溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由工作曲线求出维生素B2片试样中荧光物质的含量。
2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，基本操作荧光分光光度计的基本原理：由氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接收，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光.。
荧光分光光度计的主要部件：①光源：为高压汞蒸气灯或氙灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
②激发单色器：置于光源和样品池之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品池和检测器之间的为发射单色器，常采用光栅为单色器，筛选出特定的发射光谱。
④样品池：通常由石英池组成。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器，可将光信号放大并转为电信号。
光源发射的激发光通过入射狭缝，经激发单色器分光后照射到被测物质上，发射的荧光再经发射单色器分光后用光电倍增管检测，并经信号放大系统放大后记录。
分析化学实验：荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量
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• （二）硫酸奎宁荧光光谱的绘制 • 用10 mg/L的硫酸奎宁溶液作为测定液。 • 从380 nm到600 nm，每隔20 nm测定一次
荧光相对强度。以波长为横坐标，荧光相 对强度为纵坐标，在坐标纸上绘出荧光光 谱图，指出最大发射波长λmax为445 nm。
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（三）直接比较法测定测定硫酸奎宁含量
Cx
Fx Fs
Cs
式中：
CX——待测液的浓度； CS—标准液的浓度； FX—待测液的荧光强度 FS—标准液的荧光强度。
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定性依据： 激发光光谱 荧光光谱
定量依据：
当 l c≦0.05时,将括号项近似处理后：
F= 2.3 I0 l c = Kc
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定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，
绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样 的荧光强度，在标准曲线上求出浓度. 比较法：
实验二十八荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量系间跨越3内转换振动弛豫内转换振动弛豫4500利用荧光分析方法测定能产生荧光的物质含量对不能产生荧光的物质可以利用某些具有能发生荧光基团的有机试剂与非荧光物质形成较纯的荧光化合物然后进行测定是一种高灵敏度的分析方法
实验二十八 荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量
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在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 比较.
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荧光仪器组成： 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
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三、实验内容