中波紫外线对HaCaT细胞核因子-κB和p53表达的影响

皮肤病与性病２０１４年ｌ０月第３６卷第５翅』　塑ｎａｌ０ｌ　赶ａｎ　！　ｃｔ　２０　：　：　・论著・　２４９　・论　著・　

中波紫外线对ＨａＣａＴ细胞核因子一ＫＢ和ｐ５３表达的影响★　杨玲，黄柠，金艳霞，许速　（成都军区昆明总医院皮肤科，云南昆明６５００３２）　【摘要】　目的研究中波紫外线（ＵＶＢ）对ＨａｃａＴ细胞核因子－ＫＢ（ＮＦ－ＫＢ）和ｐ５３表达的影响。方法　以６０ｍＪ／ｃｍ　的ＵＶＢ　照射ＨａＣａＴ细胞后８ｈ、１６ｈ和２４ｈ，采用ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ等技术检测ＮＦ－ＫＢ和ｐ５３的表达情况。结果①与未处　理组相比。ＵＶＢ照射ＨａＣａＴ细胞８ｈ、１６ｈ和２４ｈ后，ＮＦ—ＫＢ　ｍＲＮＡ水平升高程度分别为２７％、３２％和４２％，ｐ５３　ｍＲＮＡ水平升高程　度分别为１３％、２０％和２８％；②未处理组ＨａｃａＴ细胞ＮＦ—ＫＢ和ｐ５３蛋白的表达水平分别为０．３９８９±０．０４８０２和０．３０１８±　０．０３６０５，ＵＶＢ照射８ｈ、１６ｈ和２４ｈ后，二者的表达均随时间延长而升高，ＮＦ—ＫＢ为０．４２８３￣０．０１９５、０．５９７６￣０．０４０１和０．８２５５￣　０．０２１４，ｐ５３为０．３９２５￣０．０２４４、０．４５９５￣０．０３６２和０．５８１１￣０．０４８２，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论ＵＶＢ可致ＨａＣａｔ细胞　中ＮＦ—ＫＢ和ｐ５３表达水平升高。　【关键词】　中波紫外线；角质形成细胞；ＨａＣａＴ细胞；核因子一ＫＢ；ｐ５３　中图分类号：Ｒ４５４，２；Ｒ３９２．３２　文献标志码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３１０．２０１４．０５．００１　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ——Ｂ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ——ＫＢ　ａｎｄ　ｐ５３　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ★　

ＹＡＮＧ　Ｌｉｎｇ，ＨＵＡＮＧ　ｌｙｉｎｇ，ＨＮ　Ｙａｎ—ｘｉａ，ＸＵ　Ｓｕ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＣｈｅｎｇｄｕ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５００３２，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ—Ｂ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ（ＮＦ—ＫＢ）　ａｎｄ　ｐ５３　ｉｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｉｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ａｎｄ　ｐ５３　ｉｎ　ｔｈｅ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＵＶＢ　ｏｆ　６０ｍＪ／ｃｍ２　ｗｅｒｅ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｔ　ｓｅｔｔｌｅｄ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　８ｈ，１　６ｈ　ａｎｄ　２４ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｎ—　ｔｒａｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ＨａＣａｔ　ｃｅｌｌｓ，ＮＦ—ＫＢ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｉｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＵＶＢ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　２７％，３２％ａｎｄ　４２％ａｔ　８ｈ，１６ｈ　ａｎｄ　２４ｈ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ，ｗｈｉｌｅ　ｐ５３　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　１３％，２０％ａｎｄ　２８％．ＮＦ—ＫＢ　ａｎｄ　ｐ５３　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ａｎｄ　ｐ５３　ｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＨａＣａＴ　ｃｅｉｌｓ　ｂｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＵＶＢ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＵＶＢ　ｃｏｕｌｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ＮＦ—ＫＢ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｉｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ—Ｂ（ＵＶＢ）；Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＫＣ）；Ｈａｃａｒｒ　ｃｅｌｌｓ；Ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ－ＫＢ（ＮＦ—ＫＢ）；Ｐ５３　

Ｅｔ光中的紫外线（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ，ｕｖ）对皮肤的炎症　损伤可引起以慢性光化性皮炎、多形性日光疹为主　要病谱的ｕＶ相关性炎症性皮肤病的发生，炎症性细　胞因子基因和细胞因子诱导基因的转录活化是此类　疾病的共同发病机制，其中，核因子一ＫＢ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ，ＮＦ—ＫＢ）是启动ｕＶ致皮肤细胞炎症损伤过程　的关键因子之一［１，２］。近年研究表明，ｕＶ可通过诱　导角质形成细胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＫＣ）凋亡以维持皮肤　内环境的稳定。从而避免外界不良刺激因素的扩　大［３ｌ４］。ｕＶ诱导ＫＣ凋亡的过程始于ＤＮＡ损伤，ｐ５３　基因在此发挥着重要的调控作用［５　３。由于ｕＶ引起　皮肤的炎症损伤在本质上源于皮肤内环境稳定性的　破坏，为了解ｕＶ诱导的细胞凋亡与细胞的炎症损伤　之间是否存在潜在的相关性，我们研究了中波紫外　线（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｂ，ＵＶＢ）对Ｈａｃａｔ细胞ＮＦ—ＫＢ和ｐ５３　表达的影响，旨在进一步探讨ｕＶ相关性炎症性皮肤　病的发病机制。　１材料与方法　１．１主要试剂及器材　１．１．１试剂ＤＭＥＭ高糖培养基（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　公司）；小牛血清（天津市灏洋生物制品公司）；　ＲＮＡｉｓｏ试剂盒（日本ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ）；ＢｉｏＲＴ　ｃＤＮＡ第　一链合成试剂盒和ＢｉｏＥａｓｙ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ试剂盒（日本ＢｉｏＦｌｕｘ）；兔抗人ＮＦ—ＫＢ多克隆　抗体、兔抗人ｐ５３多克隆抗体（美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公　司）；ＲＩＰＡ（强）裂解液、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽　提试剂盒、小鼠抗人ｐ肌动蛋白（３－ａｃｔｉｎ）单克隆抗　体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠　

【收稿日期】２０１４－０６－１５　※通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｘｕｓｕ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ；★基金项目云南省科技计划项目（２０１１ＦＺ３２１）　２５０　・论著・　皮肤病与性病２０１４年１０月第３６卷第５期Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏ１ｏ　ａｎｄ　Ｖｅｎｅｒｅｏ１。　，Ｏｃｔ　２０１４．Ｖｏ１．３６．Ｎｏ．５　ＩｇＧ、ＢｅｙｏＥＣＬ　Ｐｌｕｓ试剂盒（碧云天生物技术研究　所）。　１．１．２仪器ＵＶＢ照射仪（上海Ｓｉｇｍａ公司）：低温　高速离心机（德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；ＡＢＩ　７５００型实时　定量ＰＣＲ仪（美国ＡＢ）；ＤＹＹ一１１型电脑三恒电泳仪　（北京六一仪器厂）；半干转印仪（美国Ｂｉｏ—ＲＡＤ公　司）；Ｃｈｅｍｉ　Ｉｍａｇｅｒ　ＴＭ　５５００型凝胶成像分析仪（美国　Ａｌｐｈａ　Ｉｎｎｏｔｅｃｈ公司）。　１．２角质形成细胞培养及ＵＶＢ照射　１．２．１　细胞培养人永生化角质形成细胞株ＨａＣａＴ　细胞（本实验室冻存）。将ＨａＣａＴ细胞以１　Ｘ　１０　／ｍｌ　接种于六孔板，在３７℃、含５％ＣＯ。及饱和湿度的孵　箱中，用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ（高糖）培养。待　ＨａＣａＴ细胞生长至约６０％～８０％融合时．换无血清培　养基培养１２ｈ后，对ＨａＣａＴ细胞进行ＵＶＢ照射　处理。　１．２．２　ＵＶＢ照射ＵＶＢ照射仪置于超净台内操作．　吸去培养液后加适量消毒的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），　进行ＵＶＢ照射。根据既往研究＿３　］确定ＵＶＢ的照射　剂量为６０ｍＪ／ｃｍ　。照射结束后吸去ＰＢＳ，加人适量　无血清培养基，置于培养箱中继续培养　分别于照射　后８ｈ、１６ｈ和２４ｈ收集细胞进行检测．根据ＵＶＢ照射　后不同时相点分组。每组设４个平行样本。　１．３实验方法　１．３．１反转录一实时定量ＰＣＲ　１．３．１．１　弓Ｉ物序歹Ⅱ　人ＮＦ—ＫＢ（ｐ６５）：　＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿一　＿　一　Ｉ　（正义链）５　一　ＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣ一３　，（反义链）５　一ＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣ一３　７１；ｐ５３：（正　义链）５　一ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴ一３　，（反义链）５　一ＡＧＴＦＧＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧ一３　引：内对照　ＧＡＰＤＨ：（正义链）５　Ｌ　ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ　一３　，（反义链）５Ｌ　ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴ一　３　。引物序列由北京赛百盛生物工程公司合成。　１．３．１．２细胞总ＲＮＡ提取和反转录合成ｅＤＮＡ　按ＲＮＡｉｓｏ试剂盒说明书要求从细胞中抽提总ＲＮＡ，　紫外分光光度计测定ＲＮＡ样本的纯度和浓度。反　转录反应体系为：５×ＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ　２　ｌ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　（１０ｍＭ）１　ｌ，Ｏｌｉｇｏ—ｄＴ　０．５１ｘｌ，ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎ—　ｓｅｒｉｐｔａｓｅ　０．５　ｌ，ＲＮＡ　ｘｐ３（所加入的体积由ＲＮＡ浓度　决定，使加入的总ＲＮＡ质量约为１Ｉｘｇ），ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　Ｈ２０（５．５一ｘ）　ｌ，总体积为ｌＯｐＡ。反应条件：５０℃　４５ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ。所得ｃＤＮＡ保存于　一２０℃待用　１．３．１．３实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）ＰＣＲ反　应体系为：２×ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ（ｗｉｔｈ　４．０ｒａＭ　Ｍｇ　）２５　ｌ，　ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（ＩＯＩｘＭ）１Ｉｚｌ，ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（ＩＯＩ￣Ｍ）１Ｉｚｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．３　ｌ，　ｄｄＨ２０　１８．７１ｘｌ，ｅＤＮＡ　４ｌｘｌ，总体积为５０　ｌ。反应程　序：９４℃２　ｍｉｎ；９４￣Ｃ　１０　Ｓ，６０．５℃１５　Ｓ，７２℃３０　Ｓ，４０　ｃｙｃｌｅｓ。荧光信号采集设在７２℃（每循环第三步反应　时），ＰＣＲ结束采用融解曲线（５９℃～９５　ｏＣ）确定产　物特异性。由ＰＣＲ反应曲线得到Ｃｔ值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ，域值循环数），采用ＡＡＣｔ方法进行相　对定量，使用单一的样品来比较未知样品的目的基　因的表达。校正公式为：Ｆｏｌｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ＝２Ｉ△　Ｃｔ：ＡＡＣｔ　＝［Ｃ　目的基因（未知样品）－ＣｔＧＡＰＤＨ（未知样品）卜［ｃｔ　目的基因（校正样品）一ＣｔＧ　。　（校正样品）］。各组细胞　中的基因表达，将未处理组ＨａＣａＴ细胞中的基因表　达作为对照值１（校正样品）。另将反应产物行３％　琼脂糖凝胶电泳以确认扩增片段的特异性。　１．３．２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ按实验常规分别提取细胞核　蛋白（用于检测ＮＦ－ＫＢ）或总蛋白（用于检测ｐ５３）。　测定蛋白浓度后进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳及转膜、封闭。　膜置于一抗溶液中（工作浓度ＮＦ—ＫＢ　１：１００，ｐ５３　１：　５０，Ｂ－ａｃｔｉｎ　１：１０００），４℃过夜（≥１８ｈ），ＴＢＳＴ洗膜３　次，放入二抗溶液中（工作浓度均为１：１　０００），３７ｑｃ　摇床反应２ｈ，ＴＢＳＴ洗膜５次。滴加适量ＢｅｙｏＥＣＬ　Ｐｌｕｓ工作液（等体积混合适量ＢｅｙｏＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ａ液和　Ｂ液）到膜上，凝胶成像仪上观察，光密度分析，目的　基因条带与相应的内对照Ｂ—ａｃｔｉｎ条带的灰度值比　值（目的基因／Ｂ—ａｃｔｉｎ）作为蛋白水平的半定量指标。　１．３．３统计学处理Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ计量资料以均数±　标准差表示，采用ＳＰＳＳ　１３．０统计软件进行单因素方　差分析和组间比较，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学　意义。　２结果　２．１　ＵＶＢ照射后不同时相点ＨａＣａＴ细胞ＮＦ—ＫＢ、　ｐ５３　ｍＲＮＡ的表达３％琼脂糖凝胶电泳图显示扩增　片段与预设计片段一致（图１）。将未处理组ＨａＣａＴ　细胞中的基因表达作为对照值．从图２可以看出：①　ＵＶＢ照射ＨａＣａＴ细胞后８ｈ，ＮＦ—ＫＢ　ｍＲＮＡ水平升　高２７％．１６ｈ后升高３２％．２４　ｈ后升高４２％：②ＵＶＢ　照射ＨａＣａＴ细胞后８ｈ．ｐ５３　ｍＲＮＡ水平升高１３％，　１６ｈ后升高２０％，２４ｈ后升高２８％。ＵＶＢ照射ＨａＣａＴ　细胞后ＮＦ—ＫＢ和ｐ５３　ｍＲＮＡ水平均呈时间依赖性　升高