流感病毒实验室检测

临床采样标本接种细胞
流
程
33－35度吸附1－2小时
图
’s液清洗细胞
加入病毒生长液，33－35度培养箱培养
根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5的临床 标本
24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75～100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融1～2次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ）
• 反应体系和条件 • 试剂： ® ®
（公司： ，货号： 11732-020或 11745-100）
• 分子级无菌蒸馏水 (无酶和酶)
荧光结果－阳性样品
荧光结果－阴性样品
荧光结果－可疑样品
病毒分离细胞
标本接种细胞 33－35℃培养 每日观察细胞病变()
细胞收获
接种流程
清洗 细胞
’s液清洗细胞，一般清洗2遍
• （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。
• 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。
常规 咽拭子 鼻拭子 痰液
采集标本类型
特殊 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液
肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有： 7.4-7.6的’s液或；
荧光定量
• 第一次使用前引物稀释 • 1．引物工作浓度（40μM） • 配制方法： • （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000，
15s）。 • （2）用 溶解，加水量为10×总摩尔数，充
分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存 液。（例如：假设合成引物每管2，若2的量为 9.1 ，加水量为10×9.1＝91μl） • （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为 40μM，可作为工作浓度。
者
• 采集时间：病人发病的头3天内采集 • 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院
• 采集数量：根据就诊病例数的多少，每家哨点 医院每周至少采集5～15份流感样病例的标本 (根据流行季节、流行强度、防控工作需要实
暴发疫情标本采集
• （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例；
用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本
后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警；
• （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测 • （二）流感样病例暴发疫情监测
流感样病例监测标本采集
• 采集对象： • 流感样病例 • 发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一
荧光定量
• 引物和探针 • 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针
避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻 融）； • 涡旋振荡引物和探针； • 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
• 的试剂 • 公司 ， . 204443 • 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保
持低温。
荧光定量
核酸检测
• 核酸提取- ® • 1）在1.5 离心管中加入（病毒裂解液）560。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚
尿囊液或细胞培养液）140加入上述离心管中（粪便标本用10％ 悬液的上清），震荡15s，室温放置10。 • 3）稍离心后，加入560无水乙醇，震荡15s。 • 4）将 柱子取出，将步骤3的混合液吸取630加入柱子中， 8000离心1。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2 套管中，加入500 l液，8000 离心1。 弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2 套管中，加入500 2液，13000离心3， 弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5 离心管中，于柱中加入60的液，室 温静置1－3分钟，8000离心1，收集离心液即为提取的病毒，立 即实验或－20℃以下保存。
• 将原始标本一分为三份，一份（1）用于细 胞接种，一份（1）用于鸡胚接种，一份（1） 保存待复核。（根据检测程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测 ◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞
培养 ◆胶体金快速检测
检测流程
临床标本采集
流感病毒核酸检测阳性
接种细胞
接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
• 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 ， 多粘菌素B 250μ ）
Байду номын сангаас
咽拭子采集
• 咽拭子
•
用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维
头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽
后壁，将棉签头部浸入含3-4采集液的管中，
尾部弃去，旋紧管盖。
标本的保存与运送
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
细胞病毒分离
出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、 感染量的大小和细胞的敏感性有关
每日观察细胞病变() 标本接种后7天还未出现，维持液经试验阴
性者，继续盲传1～2代后，试验仍为阴性者， 则细胞病毒分离为阴性，标本可弃去
细胞病变图
鸡胚病毒分离
标本准备 检卵 标本接种于9日龄鸡胚 33℃～35℃培养72小时
• 未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存， 一周内送实验室
• 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。
鸡胚分离方法-试剂准备