药物的含量测定方法与验证
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药物的含量测定方法与验证
药物的含量测定方法与验证
• 药物的含量
– 含量测定 – 效价测定
• 药物含量测定方法
– 容量分析法 – 光谱分析法 – 色谱分析法
药物的含量测定方法与验证
• 方法选择中的供试品因素
– 化学原料药的含量测定首选容量分析法 – 药物制剂的含量测定首选色谱分析法 – 药物制剂的定量检查首选光谱分析法
• 含量测定方法须准确、稳定、耐用
第一节 定量分析方法的分类与特点
一、容量分析法（滴定法）
• 基本术语
– 滴定：将滴定剂通过滴管滴入待测溶液中的过程 – 滴定剂：浓度准确已知的试样溶液 – 指示剂：滴定分析中能发生颜色改变而指示终点的试 剂 – 滴定终点：滴定分析中指示剂发生颜色改变的那一点 （实际） – 化学计量点：滴定剂与待测溶液按化学计量关系反应 完全的那一点（理论） – 滴定误差：滴定终点与化学计量点不一致产生的误差
– 朗伯-比耳定律
A为吸收度，l为液层厚度，c为溶液浓度，E为吸收系数。
A Ecl
– E：单位液层厚度时的吸收度。有两种表示法
摩尔吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1mol/L， 厚度为1cm时的吸收度。用ε表示。 百分吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1% 1% E （W/V），厚度为1cm时的吸收度。用 1cm 表示。
– 阴性对照 – 阳性对照 – 纯度测试
四、检测限/定量限
• 检测限常用方法
– 目视法：非仪器法 – 信噪比法：色谱法 – 标准偏差法：光谱法
• 定量限：信噪比要求不同 • 数据要求
五、线性及范围
• 线性
– 回归方程 – 相关系数
• 范围
– 原料药和制剂含量测定 – 制剂含量均匀度检查 – 溶出度或释放度中的溶出量测定 – 特殊元素含量测定 – 杂质测定
• 化学鉴别法 • 红外光谱法
– 检查
• 溶液的澄清度 • 游离水杨酸 • 溶出度
– 含量测定
• 酸碱滴定法 • 高效液相色谱法
六、耐用性
• 耐用性 • 典型的变动因素
– 被测溶液 – 环境因素 – 液相色谱法中典型因素 – 气相色谱法中典型因素
七、验证内容的选择
• 非定量分析方法 • 定量分析方法 • 微量定量分析方法
七、验证内容的选择
项目内容
准确度
鉴别
元素或杂质检查 定量 ＋ 限度
含量测定及 溶出量测定 ＋
精密度
重复性 中间精密度 专属性② 检测限 定量限 线性 ＋ ＋
– 经水解后测定法——卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂 再水解）
• 碱水解后测定法 • 酸水解后测定法
– 经氧化还原后测定法——卤素联芳环牢固（一般用于 测碘）
样品分析的前处理方法
• 经有机破坏的前处理方法
– 湿法破坏
• • • • 硫酸-硫酸盐法——凯氏定氮法 硝酸-高氯酸法 硝酸-硫酸法 其它湿法
– 特点与适用范围
灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml. 浓度太大会有“自熄灭”作用，故适用于低浓度的 溶液。 干扰因素多，须做空白试验。 取样少，方法快速。衍生化试剂提高了适用范围
二、光谱分析法
• 荧光分析法
– 干扰的排除
溶剂：进一步纯化溶剂，空白试验 溶液：适当的浓度，减少杂质，降低溶氧，调节pH 玻璃量器：高洁净度 温度：稳定的温度
二、光谱分析法
• 荧光分析法
– 含量测定
相对定量方法测定 线性范围较窄
Ri Rib Ci Cr Rr Rrb
式中：Ci为供试品溶液的浓度，Cr为对照品溶液的浓度，Ri为供试品溶液 的读数，Rib为供试品溶液试剂空白的读数，Rr为对照品溶液的读数，Rrb 为对照品溶液试剂空白的读数。
• 高温炽灼法
– 将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结 构分解而待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐， 以供分析。根据分析对象与目的不同，常加无水碳酸 钙、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。
• 氧瓶燃烧法
第三节 药品质量标准分析方法验证
药品质量标准分析方法验证
• 方法验证的目的 • 需验证的分析项目：鉴别试验；杂质定量 或限度检查；含量测定等 • 验证内容：准确度；精密度；专属性；检 测限/定量限；线性及范围；耐用性等
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 含量测定方法
对照品比较法 Ax Cx Cr Ar 吸收系数法
Cx D 含量% 100 W
D为稀释倍数。
% （E1 1cm ) x 含量% 1% 100% ( E1cm ) r
计算分光光度法 比色法
二、光谱分析法
• 荧光分析法
• 有关计算
– 含量的计算
间接滴定法：生成物滴定法 简接滴定法：剩余量滴定法
（VA FA VB FB ) TA 含量 % 100 % W
0 S （VB VB ) FB TA 含量% 100% W
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法（200～400～760nm）
一、容量分析法（滴定法）
• 特点
– 方法简便易行 – 方法耐用性高 – 测定结果准确 – 方法专属性差
• 适用范围：较多用于化学原料药物的含量 测定
一、容量分析法（滴定法）
• 有关计算
– 滴定度：每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的 被测药物的重量。中国药典用mg表示。 – 滴定度的计算
b T (mg / ml ) m M a
一、容量分析法（滴定法）
• 有关计算
– 含量的计算
直接滴定法
V T 含量 % 100 % W
所配制滴定液浓度与规定浓度不一致时：
T T F
含量 %
F
实际摩尔浓度 规定摩尔浓度
V T V T F 100 % 100 % W W
ຫໍສະໝຸດ Baidu
一、容量分析法（滴定法）
n 5.54 (t R / W1 / 2 ) 2
2(t R1 t R 2 ) R W1 W2
• 色谱系统的重复性：RSD≤2.0% • 色谱峰的拖尾因子 T
W0.05 h 2d 1
d1为极大峰至峰前沿之间的距离。T应在0.95～1.05之间。
三、色谱分析法
• 高效液相色谱法
– 测定法
＋
＋ ＋① ＋ －③ ＋ ＋ ＋ ＋
＋
＋ ＋① ＋ － － ＋
范围
耐用性 ＋
＋
＋ ＋
＋
＋
① 已有重现 性验证， 不需验证 中间精密 度 ② 如一种方 法不够专 属，可用 其他分析 方法予以 补充 ③ 视具体情 况予以验 证
八、药品质量标准中分析方法验证 示例
• 阿司匹林及其片剂的药品质量标准
– 鉴别
• 高效液相色谱法
– 药品标准对HPLC方法改变的要求 – 对仪器的一般要求
• 色谱柱：填料，孔径与粒径，柱直径，温度，pH等 • 检测器：通用型检测器与选择性检测器，对流动相 的要求 • 流动相：反相系统与正相系统
三、色谱分析法
• 高效液相色谱法
– 系统适用性试验
• 色谱柱的理论塔板数 • 色谱峰的分离度
样品分析的前处理方法
• 在分析含金属或卤素、氮、硫、磷等元素 的有机药物前，需进行适当的药品前处理。 • 分类
– 不经有机破坏的前处理方法 – 经有机破坏的前处理方法
样品分析的前处理方法
• 不经有机破坏的前处理方法
– 直接测定法——含金属或C-M不牢固的有机金属药物
• 配位滴定法 • 氧化还原滴定法
一、准确度
• 含量测定方法的准确度
– 原料药的含量测定 – 制剂的含量测定
• 杂质定量测定方法的准确度
– 使用杂质对照品 – 缺少杂质对照品
• 数据要求
二、精密度
• 标准偏差（SD）与相对标准偏差（RSD） • 验证内容
– 重复性 – 中间精密度 – 重现性
• 数据要求
三、专属性
• 鉴别反应 • 含量测定和杂质测定
三、色谱分析法
• 特点与适用范围
– – – – 高灵敏度 高专属性 高效能与高速度 适用于药物制剂，尤其复方制剂的含量测定。
• 分类
– 依据分离原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 分子排阻色潽等 – 依据分离方式：纸色谱法，薄层色谱法，柱色谱法， 气相色谱法，高效液相色谱法等
三、色谱分析法
• 外标法：一点法；两点法；工作曲线法 • 内标法
三、色谱分析法
• 气相色谱法
– 检测器、固定液及特殊指定的色谱柱材料不能 更换 – 对仪器的一般要求
• • • • 载气 色谱柱填料，柱管材质，固定液 检测器种类，使用温度 进样方式
– 系统适用性试验 – 测定法：多采用内标法
第二节 样品分析的前处理方法
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 特点与适用范围
简便易行 灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml。 准确度较高，相对误差为2%～5%。 专属性较差 较少应用于原料药含量测定，多用于制剂的定量检 查。
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 仪器校正与检定
波长：常用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱 线校正，或用钬玻璃的尖锐吸收峰。 吸光度的准确度：与规定的吸收系数比较。 杂散光的检查 对溶剂的要求：截止波长 测定法：波长扫描与吸光度读数
– 干法破坏
• 高温炽灼法 • 氧瓶燃烧分解后测定法
经有机破坏的前处理方法
• 硫酸-硫酸盐法——凯氏定氮法
– 将含氮药物与硫酸在凯氏定氮烧瓶中共热，药物分子 中有机结构被氧化分解（亦称“消解”或“消化”） 成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氮，并 与过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵，经氢氧化钠 碱化后释放出氮气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或 定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。
药物的含量测定方法与验证
• 药物的含量
– 含量测定 – 效价测定
• 药物含量测定方法
– 容量分析法 – 光谱分析法 – 色谱分析法
药物的含量测定方法与验证
• 方法选择中的供试品因素
– 化学原料药的含量测定首选容量分析法 – 药物制剂的含量测定首选色谱分析法 – 药物制剂的定量检查首选光谱分析法
• 含量测定方法须准确、稳定、耐用
第一节 定量分析方法的分类与特点
一、容量分析法（滴定法）
• 基本术语
– 滴定：将滴定剂通过滴管滴入待测溶液中的过程 – 滴定剂：浓度准确已知的试样溶液 – 指示剂：滴定分析中能发生颜色改变而指示终点的试 剂 – 滴定终点：滴定分析中指示剂发生颜色改变的那一点 （实际） – 化学计量点：滴定剂与待测溶液按化学计量关系反应 完全的那一点（理论） – 滴定误差：滴定终点与化学计量点不一致产生的误差
– 朗伯-比耳定律
A为吸收度，l为液层厚度，c为溶液浓度，E为吸收系数。
A Ecl
– E：单位液层厚度时的吸收度。有两种表示法
摩尔吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1mol/L， 厚度为1cm时的吸收度。用ε表示。 百分吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1% 1% E （W/V），厚度为1cm时的吸收度。用 1cm 表示。
– 阴性对照 – 阳性对照 – 纯度测试
四、检测限/定量限
• 检测限常用方法
– 目视法：非仪器法 – 信噪比法：色谱法 – 标准偏差法：光谱法
• 定量限：信噪比要求不同 • 数据要求
五、线性及范围
• 线性
– 回归方程 – 相关系数
• 范围
– 原料药和制剂含量测定 – 制剂含量均匀度检查 – 溶出度或释放度中的溶出量测定 – 特殊元素含量测定 – 杂质测定
• 化学鉴别法 • 红外光谱法
– 检查
• 溶液的澄清度 • 游离水杨酸 • 溶出度
– 含量测定
• 酸碱滴定法 • 高效液相色谱法
六、耐用性
• 耐用性 • 典型的变动因素
– 被测溶液 – 环境因素 – 液相色谱法中典型因素 – 气相色谱法中典型因素
七、验证内容的选择
• 非定量分析方法 • 定量分析方法 • 微量定量分析方法
七、验证内容的选择
项目内容
准确度
鉴别
元素或杂质检查 定量 ＋ 限度
含量测定及 溶出量测定 ＋
精密度
重复性 中间精密度 专属性② 检测限 定量限 线性 ＋ ＋
– 经水解后测定法——卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂 再水解）
• 碱水解后测定法 • 酸水解后测定法
– 经氧化还原后测定法——卤素联芳环牢固（一般用于 测碘）
样品分析的前处理方法
• 经有机破坏的前处理方法
– 湿法破坏
• • • • 硫酸-硫酸盐法——凯氏定氮法 硝酸-高氯酸法 硝酸-硫酸法 其它湿法
– 特点与适用范围
灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml. 浓度太大会有“自熄灭”作用，故适用于低浓度的 溶液。 干扰因素多，须做空白试验。 取样少，方法快速。衍生化试剂提高了适用范围
二、光谱分析法
• 荧光分析法
– 干扰的排除
溶剂：进一步纯化溶剂，空白试验 溶液：适当的浓度，减少杂质，降低溶氧，调节pH 玻璃量器：高洁净度 温度：稳定的温度
二、光谱分析法
• 荧光分析法
– 含量测定
相对定量方法测定 线性范围较窄
Ri Rib Ci Cr Rr Rrb
式中：Ci为供试品溶液的浓度，Cr为对照品溶液的浓度，Ri为供试品溶液 的读数，Rib为供试品溶液试剂空白的读数，Rr为对照品溶液的读数，Rrb 为对照品溶液试剂空白的读数。
• 高温炽灼法
– 将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结 构分解而待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐， 以供分析。根据分析对象与目的不同，常加无水碳酸 钙、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。
• 氧瓶燃烧法
第三节 药品质量标准分析方法验证
药品质量标准分析方法验证
• 方法验证的目的 • 需验证的分析项目：鉴别试验；杂质定量 或限度检查；含量测定等 • 验证内容：准确度；精密度；专属性；检 测限/定量限；线性及范围；耐用性等
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 含量测定方法
对照品比较法 Ax Cx Cr Ar 吸收系数法
Cx D 含量% 100 W
D为稀释倍数。
% （E1 1cm ) x 含量% 1% 100% ( E1cm ) r
计算分光光度法 比色法
二、光谱分析法
• 荧光分析法
• 有关计算
– 含量的计算
间接滴定法：生成物滴定法 简接滴定法：剩余量滴定法
（VA FA VB FB ) TA 含量 % 100 % W
0 S （VB VB ) FB TA 含量% 100% W
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法（200～400～760nm）
一、容量分析法（滴定法）
• 特点
– 方法简便易行 – 方法耐用性高 – 测定结果准确 – 方法专属性差
• 适用范围：较多用于化学原料药物的含量 测定
一、容量分析法（滴定法）
• 有关计算
– 滴定度：每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的 被测药物的重量。中国药典用mg表示。 – 滴定度的计算
b T (mg / ml ) m M a
一、容量分析法（滴定法）
• 有关计算
– 含量的计算
直接滴定法
V T 含量 % 100 % W
所配制滴定液浓度与规定浓度不一致时：
T T F
含量 %
F
实际摩尔浓度 规定摩尔浓度
V T V T F 100 % 100 % W W
ຫໍສະໝຸດ Baidu
一、容量分析法（滴定法）
n 5.54 (t R / W1 / 2 ) 2
2(t R1 t R 2 ) R W1 W2
• 色谱系统的重复性：RSD≤2.0% • 色谱峰的拖尾因子 T
W0.05 h 2d 1
d1为极大峰至峰前沿之间的距离。T应在0.95～1.05之间。
三、色谱分析法
• 高效液相色谱法
– 测定法
＋
＋ ＋① ＋ －③ ＋ ＋ ＋ ＋
＋
＋ ＋① ＋ － － ＋
范围
耐用性 ＋
＋
＋ ＋
＋
＋
① 已有重现 性验证， 不需验证 中间精密 度 ② 如一种方 法不够专 属，可用 其他分析 方法予以 补充 ③ 视具体情 况予以验 证
八、药品质量标准中分析方法验证 示例
• 阿司匹林及其片剂的药品质量标准
– 鉴别
• 高效液相色谱法
– 药品标准对HPLC方法改变的要求 – 对仪器的一般要求
• 色谱柱：填料，孔径与粒径，柱直径，温度，pH等 • 检测器：通用型检测器与选择性检测器，对流动相 的要求 • 流动相：反相系统与正相系统
三、色谱分析法
• 高效液相色谱法
– 系统适用性试验
• 色谱柱的理论塔板数 • 色谱峰的分离度
样品分析的前处理方法
• 在分析含金属或卤素、氮、硫、磷等元素 的有机药物前，需进行适当的药品前处理。 • 分类
– 不经有机破坏的前处理方法 – 经有机破坏的前处理方法
样品分析的前处理方法
• 不经有机破坏的前处理方法
– 直接测定法——含金属或C-M不牢固的有机金属药物
• 配位滴定法 • 氧化还原滴定法
一、准确度
• 含量测定方法的准确度
– 原料药的含量测定 – 制剂的含量测定
• 杂质定量测定方法的准确度
– 使用杂质对照品 – 缺少杂质对照品
• 数据要求
二、精密度
• 标准偏差（SD）与相对标准偏差（RSD） • 验证内容
– 重复性 – 中间精密度 – 重现性
• 数据要求
三、专属性
• 鉴别反应 • 含量测定和杂质测定
三、色谱分析法
• 特点与适用范围
– – – – 高灵敏度 高专属性 高效能与高速度 适用于药物制剂，尤其复方制剂的含量测定。
• 分类
– 依据分离原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 分子排阻色潽等 – 依据分离方式：纸色谱法，薄层色谱法，柱色谱法， 气相色谱法，高效液相色谱法等
三、色谱分析法
• 外标法：一点法；两点法；工作曲线法 • 内标法
三、色谱分析法
• 气相色谱法
– 检测器、固定液及特殊指定的色谱柱材料不能 更换 – 对仪器的一般要求
• • • • 载气 色谱柱填料，柱管材质，固定液 检测器种类，使用温度 进样方式
– 系统适用性试验 – 测定法：多采用内标法
第二节 样品分析的前处理方法
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 特点与适用范围
简便易行 灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml。 准确度较高，相对误差为2%～5%。 专属性较差 较少应用于原料药含量测定，多用于制剂的定量检 查。
二、光谱分析法
• 紫外-可见分光光度法
– 仪器校正与检定
波长：常用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱 线校正，或用钬玻璃的尖锐吸收峰。 吸光度的准确度：与规定的吸收系数比较。 杂散光的检查 对溶剂的要求：截止波长 测定法：波长扫描与吸光度读数
– 干法破坏
• 高温炽灼法 • 氧瓶燃烧分解后测定法
经有机破坏的前处理方法
• 硫酸-硫酸盐法——凯氏定氮法
– 将含氮药物与硫酸在凯氏定氮烧瓶中共热，药物分子 中有机结构被氧化分解（亦称“消解”或“消化”） 成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氮，并 与过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵，经氢氧化钠 碱化后释放出氮气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或 定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。