HPLC含量测定分析方法验证中数据可接受标准讨论.

HPLC 含量测定分析方法验证中数据可接受标准讨论
在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。

为规范对各种分析方法的验证要求，中国药典2005年版附录规定了分析方法验证的指导原则。

该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。

但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。

另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。

本文提出了在对HPLC 含量测定方法进行验证时的可接受标准，供大家讨论。

1．准确度
该指标主要是通过回收率来反映。

验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD ）应不大于2.0%。

2．线性
线性一般通过线性回归方程的形式来表示。

具体的验证方法为：
在80％至120％的浓度范围内配制5份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。

以含量为横坐标（X ），峰面积为纵坐标（Y ），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R ）不得小于0.998，Y 轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。

3．精密度
1）重复性
配制6份相同浓度或分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

2）中间精密度
配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。

4．专属性
可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。

以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。

5．检测限
主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限
主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。

另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。

7．耐用性
分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH 值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，选择至少三个不同厂家或不同批号的同类色谱柱，每个条件下各测试两次。

可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于
2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，分离度应大于1.5；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。

8、系统适应性
配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。

另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，分离度应大于1.5，供试品主峰的理论塔板数应取耐用性试验不同厂家或不同批号的同类色谱柱的平均值的100%-120%。

高效液相色谱法(HPLC
色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。

二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC 技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC 的迅速发展。

目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。

现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。

HPLC 已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。

适用范围广：
已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC 分析；而其余80%有机物可用HPLC 分析。

HPLC 适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。

一次性使用医疗用品环氧乙烷残留量测试方法
G1 测试目的
以此确定产品消毒后启用时间，当产品原料与消毒工艺改变时应予测试。

G2 样品采集
于环氧乙烷灭菌后，立即从同一消毒批号的三个大包装中随机抽取一定量小包装样品，采样量至少应够作两次测试用。

分别于环氧乙烷灭菌后24h 及以后每隔数天进行残留量测定，直至残留量降至4.2条所规定的标准值以下为合格。

G3 仪器操作条件
仪器：气相色谱仪，氢焰检测器。

操作条件：
柱：Chromosorb W.HP，80目；玻璃柱长2m ，直径3mm 。

柱温：120℃。

检测器：150℃。

气化：150℃。

载气量：氮气：35mL/min；
氢气：35mL/min；
空气：350mL/min。

柱前压：108kPa 。

G4 操作步骤
G4.1 标准配制
用100mL 玻璃针筒从纯环氧乙烷小钢瓶中抽取环氧乙烷标准气（重复放空二次，以排除原有空气），塞上橡皮头，用10mL 针筒抽取上述100mL 针筒中纯环氧乙烷标准气10mL ，用氮气稀释到100mL （可将10mL 标准气注入到已有90mL
氮气的带橡皮塞头的针筒中来完成）。

用同样方法根据需要再逐级稀释2～3次（稀释1000～10000倍），作三个浓度的标准气体。

按环氧乙烷小钢瓶中环氧乙烷的纯度、稀释倍数和室温计算出最后标准气中的环氧乙烷浓度。

计算公式为：
式中：c ——标准气体浓度，μg/mL；
K ——稀释倍数；
t ——室温。

G4.2 样品处理
至少取2个最小包装产品，将其剪碎，随机精确称取2g ，放入萃取容器中，加入5mL 三氯甲烷或丙酮，充分摇匀，放置4h 或振荡0.5h 待用。

G4.3 分析
待仪器稳定后，在同样条件下，环氧乙烷标准气体各进样0.5μL ，待分析样品各进样2μL 。

根据保留时间定性，根据基线构成之面积称峰面积。

A ＝×σ×h ＝2.507σh ＝1.064 Wh/2h>峰面积（或峰高）进行定量计算。

G4.4 计算
以所进环氧乙烷标准气的微克（μg ）数对所得峰面积（或峰高）作环氧乙烷工作曲线。

以样品中环氧乙烷所对应的峰面积（或峰高）在工作曲线上求得环氧乙烷的量A （μg ），并以式（G2）求得产品中环氧乙烷的残留量。

式中：X ——产品中环氧乙烷残留量μg/g；
A ——从工作曲线中所查得之环氧乙烷量，μg ；
m ——所取样品量，g ；
V 萃——萃取液体积，mL ；
V 进——进样量，mL 。

一次性输液(血器环氧乙烷残留量检验方法探讨
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一次性输液(血器已被广泛应用于临床，国标GB8368～8369-93附录C 补充件又规定了环氧乙烷残留量的比色测定法。

其操作方法的最后部分规定“……用蒸馏水稀释至10ml, 室温放置1h, 于560nm 波长处测定吸光度，绘制吸光度-浓度曲线。

”我们在近2年多来的检验过程中发现，室温下放置时室内温度的高低对检验结果影响很大。

室温在15℃以上时，放置1h 后，标准曲线管与样品管明显出现显色反应，比色测定结果稳定。

室温在15℃以下时，特别是10℃以下放置1h, 标准曲线管与样品管几乎无显色反应，继续放置1h, 时，显色反应仍不明显，测定结果含量偏低。

而显色反应受温度的影响，温度越高，显色越快，反之，显色慢。

为此，当室温在15℃以下的，采用恒温水浴(18±2℃放置1h ，得满意结果。

1 仪器与材料
7520型分光光度计(上海分析仪器厂。

一次性输液(血器(常熟市医用器材厂。

2 实验结果
取同一厂家输液(血器10批，依法操作，按规定环氧乙烷残留量不得超过
0.5mg, 结果见附表。

附表不同温度下的检验结果(mg
编号
6±2℃
恒温水浴(18±2℃
室温(25℃
1 0.04 0.23 0.23
2 0.06 0.25 0.25
3 0.05 0.2
4 0.25
4 0.04 0.23 0.23
5 0.03 0.21 0.20
6 0.05 0.23 0.24
7 0.04 0.23 0.22
8 0.05 0.24 0.25
9 0.03 0.21 0.21
10 0.03 0.20 0.20
从附表中可看出，同一批号的样品在温度低时，测出的结果往往偏低，在恒温水浴中和室温25℃左右的条件下，测出的含量结果基本一致。

因此，当室温在低于18℃时，应采用恒温水浴放置，才可确保测定结果的正确。

我们对常熟市医用器材厂、常熟康复医疗器械厂的输液(血器均采用此法测定，取得了满意的结果。