单克隆抗体研制最详细步骤
简述单克隆抗体的制备原理
简述单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体是指由单个B细胞克隆所产生的同一种抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
制备单克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
制备单克隆抗体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物
首先需要选取与目标抗原相关的免疫原来免疫动物，一般常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、细胞表面分子等。
免疫动物可以选择小鼠、大鼠、兔子等。
2. 分离B细胞
将免疫动物的脾脏取出，制备成单细胞悬液，然后通过离心、梯度离心等方法分离出B细胞。
B细胞是免疫系统中产生抗体的主要细胞类型。
3. 杂交瘤的制备
将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞是一种白血病细胞，具有无限增殖的能力，但不产生抗体。
通过融合，可以将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤细胞的无限增殖能力结合在一起，形成具有两种细胞的特点的杂交瘤细胞。
4. 筛选单克隆抗体
将杂交瘤细胞进行分离和培养，筛选出产生特定抗原的单克隆抗体。
可以通过酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方法鉴定和筛选出单克隆抗体。
5. 大规模制备和纯化
通过大规模培养杂交瘤细胞，可以得到足够数量的单克隆抗体，然后通过柱层析、电泳等方法对单克隆抗体进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体的制备过程需要经过免疫动物、分离B细胞、杂交瘤的制备、筛选单克隆抗体和大规模制备和纯化等步骤。
这些步骤需要严格控制条件和技术，以确保制备出高质量的单克隆抗体。
大鼠单克隆抗体的制备
大鼠单克隆抗体的制备
大鼠单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
1. 免疫：将大鼠注射进目标抗原，以激发其免疫系统产生特异性抗体。
免疫可以通过多种途径进行，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 细胞融合：将大鼠脾细胞（其中包括产生特异性抗体的B 细胞）和癌症细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，得到混杂瘤细胞（hybridoma）。
3. 筛选：利用选择性培养基选择出只有混杂瘤细胞能够生长的细胞克隆。
常用的选择性培养基是含有一种受抑制性物质（如无铁血红素）的培养基，这样只有混杂瘤细胞才能继续生长。
4. 鉴定：通过酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，对每一个混杂瘤细胞克隆进行鉴定，筛选出产生特异性抗体的克隆。
5. 扩大培养：将筛选出的克隆细胞进行大规模培养，以获得足够的抗体。
6. 纯化：通过离心、蛋白A/G亲和层析、凝胶过滤等方法，对培养上清液进行纯化，得到纯的大鼠单克隆抗体。
单克隆抗体制备的原理和基本流程
单克隆抗体制备的原理和基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!单克隆抗体的制备原理与基本流程解析单克隆抗体，简称McAb，是一种具有高度特异性和一致性的抗体，广泛应用于医学诊断、疾病治疗以及科学研究等领域。
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
首先，选定合适的抗原并进行免疫，采集含有抗原特异性淋巴细胞的动物脾脏。
运用免疫规划原则，通过周期性注射抗原刺激动物的免疫系统生成大量特异性B
淋巴细胞。
其次，通过粘膜炎症急性期反应融合技术，将抗原特异性B淋巴细胞和肿瘤细胞进行融合，得到的细胞即为混源杂交瘤细胞。
然后，对获得的杂交瘤细胞进行筛选，挑选出能稳定分泌目标抗体的杂交瘤克隆。
利用ELISA、FACS等方法，能对杂交瘤筛选进行优化。
接着，研究人员会对所选克隆进行鉴定，了解其分泌的抗体与抗原的亲和力。
结合测序和质粒制备，进一步明确杂交瘤克隆的免疫学特征。
随后，利用无菌操作技术进行体外扩增和冻存，保证抗体质量的稳定。
最后，通过体内成瘤或者体外不系细胞培养的方式进行大量抗体生产，然后提取，纯化单克隆抗体。
密集摇瓶和生物反应器培养技术是临床试验阶段常用的抗体生产策略。
单克隆抗体的研究和生产是一个复杂且需要精细操作的过程，旨在通过这些步骤高效、可靠地生产出具有特异性的单克隆抗体。
对于抗体药物研发、生物技术、诊断试剂等领域，具有不可替代的重要价值。
综述单克隆抗体的主要步骤
综述单克隆抗体的主要步骤单克隆抗体是一种可以特异性识别并结合抗原的免疫蛋白，可以被广泛应用于医学诊断、治疗和研究等领域。
单克隆抗体的制备是一个复杂的过程，包括以下主要步骤：免疫原制备、细胞融合、筛选和鉴定、生产和纯化。
首先，制备免疫原是制备单克隆抗体的第一步。
免疫原可以是多肽、蛋白质、细胞、细胞器或生物大分子等。
在这个步骤中，免疫原需要经过一系列处理，如纯化、浓缩、变性等，以提高其免疫原性。
接下来，将免疫原注射到小鼠或其他动物的体内，以激发其免疫系统产生抗体。
通常情况下，免疫过程需要重复多次，以增加抗体的产生。
一般来说，免疫过程分为初次免疫和再次免疫。
获得免疫动物后，从其体内获得免疫细胞作为原始免疫细胞。
接下来，将这些免疫细胞与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞后，需要进行筛选和鉴定。
这个过程旨在鉴定并筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
一种常用的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），通过与免疫原结合来筛选出高亲和力的单克隆抗体。
通过限稀稀释法、固相筛选法或细胞流式术等鉴定方法，确定哪些杂交瘤细胞产生了具有期望效果的单克隆抗体。
得到合适的单克隆抗体后，需要进行大规模的生产和纯化。
生产单克隆抗体通常使用无脊椎动物细胞（如昆虫细胞）或哺乳动物细胞进行工程表达。
合适的表达系统可以确保抗体的高效表达和抗体质量的稳定性。
在生产过程中，需要对培养条件、培养基、收集工时等进行优化，以确保单克隆抗体的高产量和高质量。
随后，通过多种纯化方法（如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析）对抗体进行纯化，去除杂质和冗余物质。
在纯化完成后，单克隆抗体通常需要进行分析和鉴定，以确保其质量和活性。
常用的方法包括SDS-凝胶电泳、Western blot，以及免疫组化等。
总结来说，制备单克隆抗体的主要步骤包括免疫原制备、免疫过程、细胞融合、筛选和鉴定、生产和纯化。
每个步骤的确切条件和方法可能会因实验目的、免疫动物和免疫原的不同而有所不同。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程随着生物技术的发展和应用的广泛，单克隆抗体作为一种重要的生物分子工具，在医学诊断、治疗和科学研究领域发挥着重要作用。
单克隆抗体是通过体外复制细胞免疫应答过程中产生的单一克隆抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
下面将简要介绍单克隆抗体的制备过程。
第一步：免疫原的选择制备单克隆抗体的第一步是选择适当的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂类等生物大分子，也可以是一种特定的细胞、细胞表面分子或化合物。
免疫原的选择应根据需要检测或研究的目标来确定。
第二步：免疫动物的选择和免疫过程为了制备单克隆抗体，需要选择适当的免疫动物。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
免疫过程分为初次免疫和加强免疫两个阶段。
初次免疫是将免疫原注入免疫动物体内，刺激机体产生免疫应答。
加强免疫是在初次免疫后再次注入免疫原，以增强机体的免疫应答。
第三步：细胞融合和杂交瘤的建立细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤。
它是将免疫动物体内产生的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
融合细胞的选择和优化是确保制备高效单克隆抗体的重要因素。
第四步：筛选和克隆单克隆抗体细胞融合细胞后，需要进行单克隆抗体细胞的筛选和克隆。
常用的筛选方法包括限稀稀释法、酶联免疫吸附试验等。
通过这些筛选方法可以筛选出产生目标抗体的单个细胞克隆。
第五步：单克隆抗体的生产和纯化筛选出单克隆抗体细胞后，需要进行大规模培养和生产。
单克隆抗体的生产可以通过体外培养细胞和动物体内生产两种方式进行。
体外生产是将单克隆抗体细胞培养在培养基中，利用生物反应器等设备进行大规模培养。
动物体内生产是将单克隆抗体细胞移植到合适的动物体内，利用动物自身的机制产生单克隆抗体。
之后，通过各种纯化方法，如蛋白A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，从培养物中纯化出单克隆抗体。
第六步：单克隆抗体的特性研究和应用制备得到的单克隆抗体需要进行进一步的特性研究和应用。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体是由单一的细胞克隆所产生的一种抗体，具有高度的特异性和亲和力。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原制备：首先需要准备纯化的免疫原，可以是蛋白质、多肽、糖、脂类等生物大分子或小分子。
2. 动物免疫：将纯化的免疫原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
一般常用小鼠、大鼠、兔子等动物作为免疫体。
3. 细胞融合：将免疫体中的B细胞与肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
此类细胞具有B细胞的抗体产生能力和肿瘤细胞的无限增殖能力。
4. 筛选和克隆：通过细胞培养和筛选，筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化处理，即从单一细胞中分离出单一抗体。
5. 抗体纯化：将单克隆抗体进行纯化，去除杂质，得到高纯度的单克隆抗体。
这些单克隆抗体可以广泛用于生物医学研究、诊断和治疗等领域。
总之，单克隆抗体制备过程需要精确的技术和细致的操作，同时需要对免疫原、动物和培养条件进行深入了解和优化，才能获得高质量的单克隆抗体。
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制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。
制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
制备单克隆抗体的过程可以分为四个步骤：免疫、细胞融合、筛选和扩增。
第一步是免疫。
在这一步中，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，以刺激其免疫系统产生抗体。
这些抗体会被B细胞产生并分泌到血液中。
第二步是细胞融合。
在这一步中，从免疫小鼠的脾脏中收集B细胞，并与一种特殊的癌细胞（称为骨髓瘤细胞）融合。
这种融合产生的细胞称为杂交瘤细胞，它们具有两种细胞的特性：B细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
第三步是筛选。
在这一步中，杂交瘤细胞被分配到96孔板中，每个孔中只有一个细胞。
然后，每个孔中的细胞被检测其是否产生特定的抗体。
这种检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色法。
只有产生特定抗体的细胞才会被保留下来。
第四步是扩增。
在这一步中，产生特定抗体的杂交瘤细胞被扩增，以获得足够的单克隆抗体。
这些抗体可以通过培养杂交瘤细胞或通过收集细胞培养液来获得。
制备单克隆抗体的原理是利用B细胞的特异性和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，通过细胞融合和筛选，获得同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
单克隆抗体的应用非常广泛。
它们可以用于诊断、治疗和研究。
例如，单克隆抗体可以用于检测病原体、肿瘤标志物和药物残留物。
它们还可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。
此外，单克隆抗体还可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发新的生物技术产品。
制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
杂交瘤细胞单克隆抗体的生产方法
杂交瘤细胞单克隆抗体的生产方法引言：单克隆抗体是通过细胞融合技术利用小鼠或其他哺乳动物的B细胞和体外培养的瘤细胞，产生具有高度特异性和亲和力的抗体。
这项技术是单抗药物的重要生产途径，广泛应用于疾病诊断、治疗、科学研究等领域。
本文将详细介绍杂交瘤细胞单克隆抗体的生产方法。
1.免疫原制备：根据所需的特异抗原，选择合适的免疫原制备方法，如蛋白质纯化、细胞提取物、多肽合成等等。
2.动物免疫：将免疫原与适宜的佐剂混合后接种于小鼠等哺乳动物体内，以激发免疫细胞产生特异性抗体。
3.细胞融合：-收集小鼠脾细胞：在免疫充分激活后，取出小鼠脾脏，用RPMI-1640培养基洗涤脾脏，收集脾细胞。
-人工瘤细胞准备：选择一株常用的髓母细胞瘤比如SP2/0-AG14，也可选择其他合适的细胞系，使其处于良好的生长状态。
-融合操作：将脾细胞与瘤细胞以一定比例混合，使用聚乙二醇（PEG）等化学试剂促使细胞融合。
接种融合细胞于选择性培养基上，培养6-8天，直至异源杂交瘤细胞形成。
1.筛选：将培养的杂交瘤细胞转移到96孔板中，每孔一个细胞。
利用ELISA等方法检测培养上清中是否含有目标抗体。
2.克隆：将阳性细胞转移至96孔板中进行单克隆培养，待细胞生长至一定程度后，进行二次筛选，直至获得单一细胞克隆。
3.培养和扩增：将筛选出的阳性单克隆细胞培养至足够数量，以供后续大规模生产。
单克隆抗体的纯化和鉴定：1.上清收集：将培养上清收集，去除细胞残渣和沉淀，得到含有目标抗体的液体。
2.亲和层析：利用免疫亲和层析柱，如蛋白A或蛋白G层析柱，将目标抗体与杂交瘤细胞上其他蛋白质分离开。
3.纯化：将抗体溶液经过洗脱等步骤，纯化目标抗体。
4. 鉴定：利用免疫电泳、Western blot等方法验证纯化得到的单克隆抗体的特异性和纯度。
单克隆抗体的应用和储存：1.应用：将纯化后的单克隆抗体用于疾病诊断、治疗等领域，在实验室科研中用于免疫组化、免疫沉淀、免疫荧光等实验。
单克隆抗体制备的原理和基本流程
单克隆抗体制备的原理和基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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单克隆抗体研制最详细步骤 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一） 杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 （二） 基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。 1、动物免疫 (1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。 (2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 (3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞 融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。 体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。 2、细胞融合 （1） 主要试剂的配制 a、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。 &S226;不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml 100×L.G.溶液1ml 双抗溶液1ml 7.5% NaHCO3溶液1-2ml HEPES溶液1ml &S226;不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g 超纯水或四蒸水980ml NaHCO3 3.7g 双抗溶液10ml 100×L.G.溶液10ml 用1N HCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。 &S226;完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml 小牛血清15-20ml 用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。 &S226;HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml HT贮存液1ml &S226;HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml