免疫细胞检测技术
18-免疫学检测技术-重点讲解
2021/1/22
中国药科大学微生物学教研室
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二、影响抗原抗体结合反应的因素
1、抗原和抗体浓度、比例 2、温度 37℃。 3、pH 一般在pH6~8。 4、电解质 常用0.85%NaCl或磷酸盐缓冲液。
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中国药科大学微生物学教研室
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第二节 抗原或抗体的体外检测技术
一、经典的血清学检测方法
（一）凝集反应（agglutination） 概念、类别、实例
（二）沉淀反应（percipitation） 概念、类别、应用
（三）补体结合反应
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二、免疫标记技术
概念：
用途：①提高敏感性，可达到ng或pg。以便对微量 物质进行定性或定量检测，
第二十三章 免疫学检测技术 重点内容
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中国药科大学微生物学教研室
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免疫学 检测技术
抗原抗体反应特点：特异性、可逆性、 浓度和比例性、阶段性
体液免疫（血清 学）检测技术
抗原抗体反应影响因素。。。
经典血清学检测方法： 凝集反应、沉淀反应、补体结合试验
免疫标记技术：免疫荧光法、免疫酶技术、放射 免疫技术和免疫胶体金技术。
Percoll分离液
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二、免疫细胞的计数
（一）花环形成试验 T细胞与B细胞皆可应用该试验进行计数。 T细胞计数的方法——E花结试验。 B细胞计数的方法有——EA花环形成试验 。
（二）荧光抗体染色 （三）FCM
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中国药科大学微生物学教研室
免疫过氧化物酶单层细胞实验技术原理
探究细胞免疫过氧化物酶的单层实验技术原
理
免疫过氧化物酶单层细胞实验技术（简称ELISPOT技术）是一种
用于植物、动物和人体细胞免疫功能研究的先进技术。
使用这种技术
可以检测特定单个细胞所产生的蛋白质，尤其是细胞因子。
下面我们
来详细了解一下这个技术的原理：
首先，我们需要准备两个特定抗体：用于先后标记目标抗原的一
级抗体和用于探测一级抗体的二级抗体。
一级抗体绑定特定的细胞刺
激分子，二级抗体则结合一级抗体，使可见的单层反应产物形成。
接下来，将一定数量的细胞孵育在含体积固定的高浓度一级抗体
盘中。
细胞在该盘中沉淀形成单层，随后将其孵育。
在孵育的过程中，给细胞补充适当的物质用以刺激细胞因子的释放。
一级抗体可以捕捉
这些细胞因子，从而实现实验的目的。
接着，在单层的细胞上加入一定量的二级抗体。
由于二级抗体已
经标记了特殊的酶，可以很容易地鉴定单层上的细胞因子或抗原。
之后，显色液位盖在反应孔上，反应时间15至20分钟。
接着去除显色
液并使用稀释液洗涤，洗涤后观察条带或点，如果呈现出灰白或深蓝色，则代表着该点或条带中存在该抗原的细胞因子。
除了上述方法之外，ELISPOT还能够用于测定体内特定腺病毒对T
细胞的免疫刺激反应，以及对单核细胞亚群和调节细胞的分析研究等。
总结起来，免疫过氧化物酶单层细胞实验技术可以通过检测每个单个的细胞所分泌的细胞因子进行准确的结果测定。
该技术对研究免疫学和感染性疾病等领域都有着重要的应用价值。
通过不断优化实验流程和研发新的检测方法，相信该技术将在未来得到更广泛的应用。
抗体制备及免疫检测技术的原理和应用
抗体制备及免疫检测技术的原理和应用抗体是一种重要的生物分子，可以与抗原作用而具有极高的特异性。
由于抗体分子本身拥有极强的特异性和亲和力，因此被广泛应用于蛋白质分离、酶联免疫吸附试验、免疫荧光分析、免疫印迹、流式细胞术以及疫苗研究等诸多领域，也成为了生物分子分离、分析、诊断和治疗的重要工具。
本文将介绍抗体制备及免疫检测技术的原理和应用。
一、抗体制备的原理抗体是由机体B细胞分泌的一类免疫球蛋白，它由两部分组成：重链和轻链。
重链和轻链各有一端为变异区和恒定区。
抗体的制备主要有两种方法：多克隆和单克隆。
多克隆抗体是指利用多个免疫细胞杂交而制得的抗体，它的产生需要一定的时间。
单克隆抗体则是利用一个免疫细胞杂交制得的抗体，它具有较高的特异性。
使用抗体制备需要对抗原进行选择，产生抗体的条件是抗原分子必须能诱导机体产生免疫反应，即具有免疫原性。
同时，抗原还必须具有一定的抗原特异性，使得诱导机体产生的抗体具有特定的亲和性。
在制备抗体过程中，还需要进行抗体亲和纯化和抗体标记等处理，以便用于各种免疫学实验和临床诊断。
二、免疫检测技术的原理免疫学检测技术的核心原理是利用抗体和抗原之间的相互作用，检测样品中特定抗原的存在与否。
在此过程中，选择合适的检测方法可以根据不同的具体要求来设定；同时，要选取合适的抗原和抗体以确保检测的准确性和敏感性。
免疫检测技术有很多种类，其中最重要的包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射性免疫检测、免疫荧光分析、免疫印迹和流式细胞术等。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的分析方法，可用于测定血清、唾液和尿液等生物体中特定抗体或抗原的含量。
ELISA原理是利用酶标记的抗体或抗原，检测样品中特定抗体或抗原的存在。
放射性免疫检测则是采用放射性标记的抗体分子，通过测定放射性计数来检测样品中的抗原分子。
这种方法的优点是高灵敏度和准确性，但不适用于现场检测。
免疫荧光分析是利用荧光标记的抗体与荧光标记的抗原相互作用，检测样品中特定的抗原或抗体。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
4.免疫电镜细胞化学技术
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂 块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收， 浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察
。
3、假复型技术：
琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的 形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。 此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不 必要的杂质；比较费时。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固 定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
免疫电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
基本原理：
铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分 子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm ），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域 ，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此 可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联 剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免 疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核 心，便于电镜观察。
各种免疫学方法
各种免疫学方法
免疫学中有很多种方法，以下列举其中一些：
1. 免疫细胞分离和培养：通过离心和分层技术，可以从体内分离出免疫细胞，如淋巴细胞、单核细胞等，并在体外培养它们以进行后续实验。
2. 免疫组化和免疫荧光：这些技术用于检测和定位免疫细胞和抗原在组织中的分布。
通过使用特定的抗体标记，可以在显微镜下观察到这些标记物。
3. 流式细胞术：这是一种常用的技术，用于分析和鉴定免疫细胞的表型和功能。
通过使用荧光标记的抗体，可以通过流式细胞仪检测和分离特定的细胞亚群。
4. 免疫沉淀和免疫印迹：这些技术用于检测和分离特定的蛋白质。
通过与目标蛋白质特异性结合的抗体，可以将其从复杂的混合物中分离出来，并通过免疫印迹技术进行检测。
5. 免疫基因学：这是通过研究免疫相关基因的表达和功能来了解免疫系统的方法。
包括使用PCR、实时荧光定量PCR和基因敲除等技术。
6. 酶联免疫吸附试验：这是一种常用的免疫学检测方法，通过将待测抗原或抗体与酶结合，再利用酶的催化作用对待测抗原或抗体进行放大信号反应，以提高检测的灵敏度。
7. 血清凝集试验：这是一种检测抗原或抗体的方法，通过将待测血清与已知抗原或抗体在体外进行反应，观察是否发生凝集现象来判断待测血清中是否存在相应的抗原或抗体。
8. 补体激活试验：这是一种检测补体系统活性的方法，通过观察补体系统被激活后对病原微生物的杀伤作用来评估机体的免疫功能。
9. 疫苗接种：通过接种疫苗来激发机体产生特异性免疫反应，以提高机体的免疫力，预防相应的疾病。
以上各种免疫学方法各有特点，适用于不同的应用场景。
在实际应用中，应根据具体情况选择合适的方法。
免疫学实验技术新进展
免疫学实验技术新进展免疫学作为生命科学的重要分支，一直以来都是医学和生物学研究的热点领域。
随着科学技术的不断发展，免疫学实验技术也在不断创新和完善，为免疫学研究和临床应用提供了更强大的工具和手段。
本文将介绍一些近年来免疫学实验技术的新进展。
一、单细胞免疫分析技术单细胞免疫分析技术是近年来免疫学领域的一项重大突破。
传统的免疫分析方法通常是对大量细胞群体进行平均化的测量，无法揭示单个细胞之间的异质性。
而单细胞免疫分析技术能够在单个细胞水平上对免疫细胞的表型、基因表达、蛋白质分泌等进行精确分析，为深入了解免疫系统的复杂性和多样性提供了有力的手段。
例如，单细胞 RNA 测序技术（scRNAseq）可以同时检测数千个单个细胞中的基因表达谱，帮助研究者发现新的免疫细胞亚群和细胞状态转换。
流式细胞术与单细胞分选技术的结合，可以对特定的免疫细胞进行分离和后续的深入分析。
此外，质谱流式细胞术（CyTOF）能够同时检测大量蛋白质标志物在单个细胞中的表达，提供了更全面的细胞免疫表型信息。
二、免疫组库分析技术免疫系统的多样性主要体现在 T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）的基因重排上，形成了庞大的免疫组库。
免疫组库分析技术通过对 TCR 和 BCR 的基因序列进行测序和分析，可以了解免疫系统在不同生理和病理状态下的动态变化。
新一代测序技术（NGS）的应用使得大规模、高通量的免疫组库分析成为可能。
通过对 TCR 和 BCR 的可变区基因进行测序，可以评估免疫细胞的克隆多样性、克隆扩增情况以及抗原特异性等。
免疫组库分析在肿瘤免疫、自身免疫性疾病、感染性疾病等领域都具有重要的应用价值，有助于揭示免疫系统与疾病发生发展的关系，为疾病的诊断和治疗提供新的靶点和策略。
三、成像技术在免疫学中的应用成像技术在免疫学研究中的应用越来越广泛，为直观地观察免疫细胞在体内的分布、迁移和相互作用提供了重要手段。
共聚焦显微镜和双光子显微镜能够在细胞水平上实时观察免疫细胞与靶细胞之间的相互作用，以及细胞内的信号转导过程。
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免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。
各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。
本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。
一．免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。
它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。
细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质(表面标记)来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。
根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。
免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。
基于细胞物理性状的分离方法(一)根据各种细胞比重的差异1.自然沉降法2.密度梯度离心法人外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.00左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075左右。
利用密度在l.077万±0.001之间近于等渗的Ficoll-Hypque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。
血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o（如图1-1所示）图1-1 淋巴细胞分离示意图3.改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心将T细胞分离。
（二）根据细胞吸附特性巨噬细胞能够非特异性粘附于玻璃或塑料表面，根据这种特性可以将巨噬细胞从混合细胞群体中分离;B细胞能够粘附于尼龙棉上.通过尼龙棉柱时被阻滞，从而将其与其他细胞分开。
(三}根据细胞对渗透压变化的敏感度倒如红细胞对低渗敏感.通过低渗处理能够裂解红细胞。
基于细胞表面标记的分离方法(一)补体细胞毒分离法采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。
{二}免疫磁珠分离法磁性微珠是上世纪80年代初以高分子材料和金属离于(如Fe3O4)为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。
在班液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。
免疫磁性微珠主要用于细胞的分离和纯化，其基本原理及步骤是:首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，便与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。
免疫磁珠分离细胞方法简便，快速，无需特殊的设备，且分离纯度高，产率大，近年来已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T、B淋巴细胞、内皮细胞、造血祖细胞、单核/巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。
近年来，人们又开发出与生物素结合的单抗—亲和素/链霉亲和素-生物素结合的磁性微珠的实验方法，这种方法旨在利用生物素-亲和素间的高亲和力和生物放大作用来增强磁性微珠与细胞的结合力，从而提高细胞的分离效率。
为了对细胞分离效果迅速进行分析，可将荧光素(如FITC)标记在亲和素/链毒亲合素表面，使所分离的细胞在流式细胞仪(FCM)上立即得到测定分析，从而省去了免疫荧光染色的时间。
{三}流式细胞术流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。
（其基本构成框架见下页图1-2）其工作原理及特点为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下同时进行流室，形式鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下(1000-5000个细胞/s)与垂直而来的激光束交汇。
在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗拉多少及DNA含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受;细胞上着染的荧光染料在激发光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接受，所有信号自动传入电子计算机分析处理，迅速藐测得细胞类群及其数量的信息。
由高颇超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同的细胞类群的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收集于不同容器内。
图1-2 流式细胞仪组成示意图流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒(如细菌)等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
将荧光标记的单克隆抗体加人PBMC悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每非高达5000个细胞的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%-99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
免疫细胞功能的检测第一节免疫细胞数量的检测一、通过检测表面标志(CD分子)检测各类免疫细胞的数量免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及及活化过程中，其细胞膜表面均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。
其中CD分于常作为各类免疫细胞的表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞含量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
{一}免疫荧光染色技术利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克隆抗体(McAb)直接与人淋巴细胞反应；或用际记有荧光素的羊(或兔)抗鼠IgG作为第二抗体，再借助McAb的介导与人淋巴细胞结合。
在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景下发出黄光，凡是呈现特异性黄光的细胞即为阳性细胞，计数阳性细胞，从而确定T细胞各亚群的百分率。
上述方法分别称为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。
{二)微量细胞毒试验在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分于的McAb与相应的CD分子结合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈红色。
而无相应CD分于的细胞则不受损伤，因而不着色。
计数死亡细胞数，即可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞的亚群。
该方法简便易行，准确性较高。
（三）红细胞花环法采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞(SRBC)结合，制成致敏的SRBC o抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞周围形成花环。
通过计数花环形成率，从而确定T淋巴细胞各亚群。
该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。
{四}免疫酶染色技术(ABC法)抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。
免疫酶染色技术正是根据此原理用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分于遇到底物时，能催化底物水解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。
该方法具有敏感性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就观察等优点。
但有时也存在非特异性染色影响。
其基本的方法是将亲和素与酶标生物素反应形成复合物(ABC)，再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗人T细胞亚群的McAb(第一抗体)介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。
（五)流式细胞术前面已经有所介绍，流式细胞术（FCM）是一种高速度、高灵敏性、高精度和高分辨率的自动分析细胞的高新技术。
主要用于定量分析单细胞表面、细胞内抗原和对分子水平的核酸含量的测定。
二、抗原特异性T细胞数量的检测一MHC/多肽四聚体法T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC/抗原肽复合物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。
因此，可以用MHC抗原肽/复合物检测T细胞表面的特异性TCR，来反映抗原特异性T细胞数量的变化。
Altman等首次发明MHC/多肽四聚体方法并应用于检测可识别HIV抗原肽的特异性CTLs，获得成功。
后经Walter等改进，成为检测和研究抗原特异性T细胞数量和功能的新技术。
可溶性MHC/多肽四聚体方法敏感性高，克服了传统方法的局限性，可用于各种抗原特异性T细胞表型分析、分离和克隆化，也可用于检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞数量，为研究与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、快速、敏感的研究手段。
其基本方法是将体外表达的MHC重、轻链分子及短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，形成MHC/多肽复合体，再经过纯化，并借助于半胱氨酸的巯基与生物素结合，然后将一个标记荧光的链章含亲和素与4个生物素标记的MHC-肽复合体结合形成四聚体。
这种MHC多肽四聚体与抗原特异性T细胞上的TCR 结合后，即可通过灵敏度很高的流式细胞仪(FACS)进行检测。
第二节T、B淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。
体内主要是进行迟发型超敏反应.借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功能的测定。
淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态.而且是免疫缺陷诊断断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转归。
一、T、B淋巴细胞增殖反应测定淋巴细胞体外增殖反应是检测细胞免疫功能的常用方法。
剌激淋巴细胞增殖的物质可分为二大类:①非特异性剌激物:如植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A(ConA)、美洲商陆(PWM)、佛波酶(PMA)等有丝分裂原;能产生A蛋白的葡萄球菌(SAC)、EB病毒、链球菌溶血毒素S、细菌脂多糖(LPS)等微生物及其代谢产物;胃蛋白酶、膜蛋白酶等蛋白物质;抗CD3、CD2、IgM等细胞表面标志的抗体以及某些淋巴因子等;②特异性剌激物:主要是特异性抗原物质，包括各种可溶性抗原和细胞表面抗原。