蛋白酶抑制剂

血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用年级：2006级预防1班学号：200609010125 姓名：彭秀
摘要：随着医学上对血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 的深入研究，发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值，而且在肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等方面也具有一定的价值。

本文旨在研究血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用。

关键词：血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C ；测定方法；临床应用
血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)是一种非糖基化的碱性蛋白产物。

Cys C由人体内的有核细胞产生，生产率稳定，不受个体肌肉量、性别、年龄、肾前因素和慢性炎症的影响。

Cys C是人体内最重要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一，是目前发现的对组织蛋白酶B 抑制作用最强的物质。

随着科学研究，发现其不仅在肾脏疾病方面具有临床价值，而且还发现了它与肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等具有一定的相关性。

1血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定方法
Cys C的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。

目前，我国l}缶床实验室测定Cys C的方法主要有颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)和颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)2种。

PETIA：将抗胱抑素C、IgG共价结合到均一的胶乳颗粒上，与抗原结合形成的免疫复合物被聚乙二醇一6000沉淀，在特定的波长处比浊，与同样处理的校准液比较，计算标本中胱抑素c的含量。

此法反应时间短，精密度好，检测范围宽、黄疸、溶血和脂血标本均不受影响，是目前使用非常广泛的一种检测Cys C的方法。

PENIA：将抗人胱抑素c的多克隆抗体标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上，利用胶乳颗粒增强的免疫散射比浊法测定。

此法优于PETIA法，反应时间短，精密度好，检测范围宽，不受血红蛋白、胆红素和甘油三酯、类风湿因子和骨髓瘤异常蛋白的影响。

但试剂成本较高，需要特定的检测仪器。

2 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 临床应用
2．1 Cys C与肾移植
肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法，因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为f临床工作之重点。

王盛华等人的研究发现，cvs c在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐，即Cvs C比Scr提前(2．7~1．8)d升高；与排斥前比较，Cys C升高148．9％，远高于Scr的43．9％。

Le Bficon等也曾报道，Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显，更有利于肾移植的临床监测。

cvs c在肾移植术后诊断感染时虽然升高幅度与Scr 无明显差异，但比Scr早(4．4~1．5)d出现变化，有利于早期发现，这对肾移植患者来说有重大临床意义。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，Cys C)为非糖基化蛋白质，分子量为13 kDa，等电点约为9．3由有核细胞产生。

Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一，是一种低相对分子量的碱性非糖化蛋白质。

Cystatin C几乎任何器官都能表达，广泛存在于各种组织的核细胞和体液中，脑积液中的浓度最高，尿中的浓度最低。

Cystatin C能自由通过肾小球滤膜，并在近曲小管几乎完全被重吸收和降解，不再回到血液中，同时也无肾小管分泌。

其重吸收后被完全分解代谢对肾小球滤过率有微小变化比较敏感。

随着检测手段的不断完，cvstatin C作为肾脏早期损害的检测指标已越来越得到认可。

它能激活中性粒细胞，
使炎症介质介导炎症反应，进一步加重血管内皮损伤。

血中的浓度不受其他因素如性别、年龄、饮食、肌肉、炎症、感染等因素的干扰，它是反映GFR变化的良好指标。

采用透射比浊法在Olympus AU2700自动生化分析仪上检测血清Cys C的浓度，同时测定血肌酐、24 h尿肌酐并计算肌酐清除率(Ccr)。

统计分析血清Cys c和血cr分别与Ccr 的相关性，并对血清Cys C和血cr的诊断敏感性、特异性子以比较分析。

实验结果显示血清Cys C与血cr之间具有很好的正相关性(r=0．8380)，血清Cys C与Ccr的相关性(r=一0．6207)优于血cr与Ccr的相关性(r=一0．5993)。

在Ccr~>80 mlfmin的病例中有65．79％的病人血清Cys C异常。

由此得出血清Cys C在诊断肾小球滤过率(GFR)方面比血肌酐具有一定的优越性，尤其在肾脏的早期损害中意义更大。

2．2 Cys C与肝脏疾病
Cvs C在肝脏疾病患者中显著升高，且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高变化推断Cys C与肝病的严重程度相关。

血清Cys C在乙肝、丙肝、肝硬化及肝癌升高的阳性率分别为90％，93％，100％，100％，高于常用的生化指标。

该研究还发现：各肝病组ALT、AST、GGT、TBIL等指标与正常对照组比较差异非常显著，但各肝病组间差异不是很明显。

CysC是近年来反映肾小球滤过率新的内源性标志物。

肝脏是葡萄糖代谢的重要器官，慢性乙型肝炎疾病发展过程中常会导致糖代谢的异常。

本研究探讨CysC与慢性乙型肝炎糖代谢的关系，旨在为尽早诊断慢性乙型肝炎糖尿病提供临床依据。

尿微量白蛋白采用美国Beckman-Coulter公司的IMMAGE全自动免疫比浊仪及原装配套试剂检测。

CysC采用Beckman-Coulter公司LX-20全自动生化仪及原装配套试剂检测。

糖化血红蛋白(GHBAIc)采用美国BI()IRAD公司全自动糖化血红蛋白仪检测，试剂、校准品均为公司配套产品。

研究结果显示，慢性乙型肝炎患者、慢性乙型肝炎合并糖尿病患者CysC水平均高于对照组，表明炎症导致肝脏病理织学损伤。

血CysC在诊断慢性乙型肝炎患者合并糖尿病时具有较高的价值，同时结合U—MAlb可用于慢性乙型肝炎合并糖尿病患者肾损伤的早期诊断，为临床早发现、早干预、早治愈慢性乙型肝炎合并糖尿病提供重要的实验室依据。

2．3 Cys C与糖尿病肾损害
糖尿病肾损害的主要病理改变为肾小球基底膜受损，而作为全部肾功能单位滤过率的总和，GFR是评价肾功能受损的一项好的指标，国内外很多研究都说明Cys C在评价肾损害比Scr要更为灵敏特异。

糖尿病肾病是糖尿病常见而严重的并发症，其早期诊断和治疗极为重要，微量清蛋白是实施干预治疗的关键时期。

糖尿病肾损害是糖尿病严重的慢性微血管并发症，也是糖尿病人的主要死因之一，故糖尿病肾损害的早期诊断和及时治疗有重要意义。

用胶乳增强的速率散射比浊法测定Cys C 。

用酶法测定血清和尿肌酐，并计算内生肌酐清除率（Cer）值。

其测定结果显示Cer在40—80ml/(min*1.73m2)时，Cys C和Ser的值与正常对照组比较只有Cys C有显著差异（p<0.01）；Cer<40 ml/(min*1.73m2)时，其Cys C和Ser的值与正常对照组比较均有显著差异（p<0.01）。

由此而得出血清Cys C可以有效的反映糖尿病患者肾损害的程度。

2．4 Cys C与肿瘤
Strojan收集了82例头、颈部鳞状细胞癌患者的癌组织和其相匹配的癌旁组织，应用ELISA对组织中Cys C的浓度进行检测。

他们在将癌组织与癌旁组织中的Cys C的表达量进行统计学分析后发现，肿瘤样本Cys C的平均浓度要比癌旁组织中低了1．18倍(p=0．041)，其中喉部肿瘤Cys C平均浓度要比与其相匹配的正常组织中的量低1．42倍(p=0．029)而非喉部肿瘤与其相匹配的癌旁组织间未发现明显差异。

喉部肿瘤Cys C平均浓度(16．9 ng ／mg．P，即每毫克总蛋白中含(16．9ng的Cys C)高于非喉部肿瘤Cys C平均浓度(14．8 ng
／nag．P)，两者之间也无明显差异；同时他们还发现癌旁组织中Cys C的表达量与其组织来源有关，喉部肿瘤的癌旁组织中Cys C表达量(24．0 ng／mg．P)要高于非喉部肿瘤的癌旁组织(11．5 ng／mg．P，p=0．004 )，肿瘤Cys C的水平与患者的性别、年龄、肿瘤组织病理学分级、国际抗癌联盟(UICC)肿瘤病理分级(pTNM)分级(根据原发肿瘤的大小及范围，局部淋巴结受累情况以及肿瘤转移情况3项指标对肿瘤进行病理学分期)、原发肿瘤(PT)分级(PT0为手术切除物的组织学检查未发现原发肿瘤；PT1、PT2、PT3、PT4为原发肿瘤逐级增大；PT x为手术后及组织病理学检查均不能确定肿瘤的浸润范围)、颈部淋巴结转移等之间无直接联系，但与肿瘤组织局部淋巴结转移(PN)分级(PN 0为未见局部淋巴结转移；PN1、PN2、PN3为局部淋巴结转移逐渐增加；PN4为邻近局部淋巴结转移；PN x为肿瘤浸润范围不能确定)之间呈负相关[(PN0：18．4ng／mg．P+局部淋巴结转移阳性(PN+)：14．2ng／mg．P+ p=0．047) ]；已扩散的肿瘤组织中Cys C的含量(14．0 ng／mg．P)要低于未扩散的肿瘤组织(17．4ng／mg．P，p=0．069)，而这种患者的愈后及生存率都较差Strojan等检测了34 头、颈部麟状细胞癌患者血清Cys C的浓度．样本分为确诊后未治疗的A组和治疗后7～407 d(平均59 d)的B组．另外30名正常人的血清作为C组。

结果发现A组中Cys C的平均浓度为573 ng／m1 (P<0．000 1)，B组为551 ng／m1 (P<0．000 1)，与C组的320ng／mI 相比．A、B组的Cys C的浓度显著升高，而A、B组之问并无差异(P>0．05)；并发现A组Cys C的浓度与肿瘤所处的部位有关(P=0．035)．非喉部肿瘤患者血清Cys C的平均浓度(658ng ／mL)要显著高于喉部肿瘤患者血清Cys C的平均浓度(529 ng/ mL)；通过对B组中治疗后超过45d和疾病未复发的患者血清的检测，还发现随着患者治疗时间的不断延长，Cys C含量不断降低。

研究结果可以证实Cys C与肿瘤向外浸润和转移有关，半胱氨酸蛋白酶B也参与这个过程他们之间的平衡失调可能是引起肿瘤向外浸润和转移的一大因素：但是Cys C在不同类型的肿瘤或同一类型的肿瘤在不同病理时期表达状况不同，因此Cys C的表达状况是否会随着肿瘤的发展而改变?其表达的量与活性与肿瘤侵袭、生长和转移的关系如何?现在还不是很清楚有待做进一步的深入研究。

2．5 Cys C与心血管疾病
Cys C与动脉硬化研究发现，在血管平滑肌细胞中有该组织蛋白酶抑制剂Cys C的表达，Cys c可通过人类多核细胞趋化性的抑制而在人类免疫防御中其作用。

在血管损伤后炎症因子产生增加，轮流刺激血管损伤处促使胱氨酸蛋白酶含量增加，加速血管损伤，而这一作用可被Cys C所抗衡。

然而在动脉粥样硬化及腹主动脉瘤的损伤处Cys C的表达则严重减少。

Per等检测了急性心肌梗死患者急性期、恢复期及健康对照组的血清Cys C水平，发现两者的Cys C水平均显著低于健康对照组，提示Cys C的血清浓度改变，在一定程度上可以作为急性心肌梗死诊断的参考指标。

2.5-1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂c与高血压近年来高血压病引起的肾功能衰竭发生率呈逐年增高趋势，高血压病患者中轻度肾损害较常见，但现用的肾功能检查指标不能发现早期。

肾损害。

崔蒙等对549例高血压病患者的m清cystatin c和cr进行检测，得出高血压病患者血清cystatin C增高而Cr正常者在所有高血压病患者中所占比例达44．3％。

所以，通过检测高血压病患者的血清cystatin c有助于发现血清cr正常的早期肾功能损害。

watanade 等调查研究了血清cystatin C水平与原发性高血压病人肾脏心脏和血管等终末器官损害的关系。

60名原发性高血压患者参与了此研究，结果显示：血清cystatin C与24 h平均收缩压(24 h—SBP)相关(r=0．308，P= 0．0l6 7)，与左心室体积指数(LVMI)相关(r=0．528，P<0．000 1)，与血管内膜厚度(IMT)相关(r=0．539，JP<0．000 1)。

本实验证明了血清cystatin C水平是原发性高血压病人终末器官损害的早期指标。

2.5-2 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与冠心病最近认为除基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶之
外，溶酶体的半胱氨酸蛋白酶也参与动脉粥样硬化发病机理。

组织蛋白酶s、K、c、V和W 都是半胱氨酸蛋白酶的成员，在溶酶体外也起作用。

在人类动脉粥样硬化病变和在载脂蛋白E缺失的动脉粥样硬化的老鼠模型(ApoE-／)中过表达了促弹性组织解离和溶胶原的组织蛋白酶S和K，而它们的内在抑制剂cystatin C的表达相对减少。

动脉粥样硬化发展期间，血管平滑肌细胞中的cystatin c缺乏局限在动脉粥样硬化斑块和动脉瘤组织中。

炎症细胞因子使培养的单核细胞来源的巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞中活性半胱氨酸蛋白酶的表达和分泌增加，但细胞因子对cystatin c的影响很小。

这表示半胱氨酸蛋白酶和它们主要抑制剂之间平衡的转换促进细胞外基质和内弹性膜的降解，并促进单核巨噬细胞和血管平滑肌细胞的运动。

不易出现动脉粥样硬化的表型正常的ApoE缺失老鼠和cystatin c缺失老鼠杂交育种，结果出现严重的动脉粥样硬化和主动脉扩张。

另外，值得调查的是：ApoE缺失老鼠模型的动脉粥样硬化病变中cystatin c表达和分泌的减少是否转变成血清cystatin C。

为了以蛋白酶／抗蛋白酶比例失衡的观点评价血清cystatin C在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用，董巧玲等探讨了血清cystatin C在急性心肌梗死不同时期的浓度变化，急性心肌梗死患者早期血清cystatinC水平(0．78±0．15)与不稳定型心绞痛(O．89±O．22)、对照组(0．84±0．21)相比明显降低(P= 0．028)，但急性心肌梗死发病1周后(1．28±0．2O) 接近正常，甚至有所增高(Jp=0．04)。

急性心肌梗死患者早期血清cystatin C浓度的显著降低，在一定程度上可为临床诊断急性心肌梗死提供参考。

血清cystatin c和心血管发病病死率的关系很可能反映早期肾脏功能不全。

在病变血管中细胞因子介导的半胱氨酸蛋白酶的增加和cystatin c低表达之间的不平衡状态促进了动脉粥样硬化和动脉瘤病变。

微环境炎症也许是两个过程之间的病理生理联系。

总之，cystatin C是一种较理想的评价GFR的指标，在多种常见心血管疾病中有很大的应用前景。

目前血清cystatin C的检测分析已实现全自动化且检测简便，未来进一步展开研究，将有希望在临床得到广泛应用。

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