红豆杉细胞培养中紫杉醇高产细胞株的筛选及其稳定性分析
高中生物 第二章 课时7 植物细胞工程课后作业(含解析)苏教版高二选修3生物试题
第7课时 植物细胞工程目标导航 1.掌握植物组织培养的原理、过程及其特点。
2.理解人工种子的制备方法、过程及其意义。
3.理解植物细胞培养的方法、过程。
4.举例说出植物细胞工程的应用。
一、植物组织培养1．细胞的全能性(1)概念：生物体细胞在________________上存在很大差异，但每一个细胞都具有该物种的__________________________，都具有____________________________________，也就是说，每个细胞都具有________________________的潜能。
(2)证据：植物的体细胞在适宜的条件下可培养成________________。
2．植物组织培养(1)概念：是指依据______________原理，在________条件下，分离植物的____________________________(外植体)，并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成________________的技术。
(2)培养材料：________________________等。
(3)培养过程离体的植物器官、组织或细胞或原生质体――→脱分化____________――→再分化______或________―→试管苗①愈伤组织：是一团没有__________________并处于____________状态的______细胞。
②脱分化：指____________的植物细胞形成______________________的过程。
③再分化：____________重新被诱导分化形成______等器官的过程。
(4)人工种子①概念：是指在________________中得到的________________，包埋在含有营养和保护物质的包被中，在适宜条件下能够____________的颗粒体。
②结构：________外包裹__________和__________。
二、植物细胞培养1．概念：将组织培养过程中形成的____________或其他易分散的组织置于__________中，进行__________，得到分散游离的悬浮细胞，通过____________使细胞增殖，从而获得大量的____________的一种技术。
紫杉醇(Taxol)
紫杉醇的化学半合成
有机合成不仅有效地解决了紫杉醇分离提纯难题 ，同时，通过对紫杉醇及其衍生物进行化学修饰 ，使之具有更好的制剂性和生物活性。
美国BMS公司、法国普朗克制药公司等生产紫杉 醇的主要企业现已利用半合成法进行工业化生产 紫杉醇。
紫杉醇的化学全合成
紫杉醇是分子结构比较复杂的手性化合物，现已 完成6条合成路线，总结归纳起来主要有直线法、 会聚法以及这2种方法的联合应用。
利用红豆杉侧芽通过离体培养获取大量的种苗，规模 化、集约化营造原料林
根培养法
利用根癌农杆菌侵染红豆杉的叶片获得发状根，从中 提取紫杉醇
植物细胞培养法
紫杉醇是植物细胞的次生代谢产物，能否通过大 规模的植物细胞培养大量获取紫杉醇具有很高的 研究价值。
许多研究者在高产细胞系的选择和代谢调控方面 进行了大量的卓有成效的研究。
—紫杉醇能结合并稳定微管， 阻止微管的解聚
—导致细胞分裂时不能形成纺 锤体，有丝分裂受阻，细胞周 期停滞于G2/M期
紫杉醇的临床使用
—一线广谱抗癌药
—主要用于治疗乳腺癌，卵巢癌，非小细 胞肺癌和卡波西肉瘤
—聚氧乙基代蓖麻油与无水乙醇的混合溶媒具 有致敏性，直接注射的过敏率高达34.17%
—用药前需对患者注射受体拮抗剂，以降低过 敏反应的发生
目前未能实现工业化生产，这主要是因为：植物 细胞生长慢，紫杉醇含量低，使得单位时间单位 质量细胞紫杉醇含量较低，即使在理论上工业化 生产也难以取得经济效益。
工厂化生产方法
目前，已经应用于大规模工业化生产紫杉 醇的方法主要有两种：
从人工栽培的植物中提取紫杉醇 紫杉醇半合成法
紫杉醇与多烯紫杉醇
紫杉醇的来源
平均每棵树仅能提供 2 kg 左右的树皮,紫杉树矮小, 长 势极为缓慢，1kg干树皮只能提取50~100mg的紫杉醇。 据布一迈施贵宝公司估计, 每例病人的治疗剂量为 150mg/m2, , 对一位体表面积1.6 m2的人, 每个疗程总 剂量为250mg, 每3周为一疗程, 约需3~6个月的疗程,需 要紫杉醇约2g。
利用红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇
利用红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇摘要：I.简介- 红豆杉和紫杉醇的背景介绍II.愈伤组织的提取- 什么是愈伤组织- 为什么愈伤组织可以用于提取紫杉醇- 提取过程的步骤III.紫杉醇的用途- 紫杉醇的药用价值- 紫杉醇在医药领域的应用IV.结论- 利用红豆杉愈伤组织提取紫杉醇的意义- 未来展望正文：I.简介红豆杉是一种常绿乔木，属于紫杉科。
它不仅是一种观赏植物，还具有很高的药用价值。
红豆杉中提取出的紫杉醇是一种抗肿瘤药物，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等多种癌症具有显著的疗效。
因此，研究如何高效地从红豆杉中提取紫杉醇具有重要的意义。
II.愈伤组织的提取愈伤组织是植物在受伤后产生的一种特殊的组织，它能够进行迅速的分裂和生长。
红豆杉的愈伤组织位于树皮内侧，含有丰富的紫杉醇。
通过在红豆杉的愈伤组织上切割出小片，然后将其浸泡在一种特殊的提取液中，可以有效地提取出紫杉醇。
提取过程的步骤主要包括：红豆杉愈伤组织的收集、切割、提取液的配制、浸泡、提取、浓缩和纯化。
其中，提取液的配制和浸泡过程是影响提取效率的关键步骤。
III.紫杉醇的用途紫杉醇是一种具有广泛药用价值的物质，可以用于治疗多种癌症。
紫杉醇能够抑制癌细胞的分裂和生长，从而达到治疗癌症的目的。
目前，紫杉醇已经成为治疗卵巢癌、乳腺癌等癌症的重要药物之一。
除了用于治疗癌症外，紫杉醇还具有其他的药用价值。
例如，紫杉醇可以用于治疗糖尿病、病毒感染等多种疾病。
因此，研究如何高效地从红豆杉中提取紫杉醇具有重要的意义。
IV.结论利用红豆杉愈伤组织提取紫杉醇是一种有效的方法。
通过改进提取技术和提高提取效率，可以更好地利用红豆杉资源，为治疗癌症等疾病提供更多的药物资源。
改进的HPLC法测定红豆杉植物和细胞培养物中紫杉醇的含量
维普资讯
植物资源与环境学报
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改进 的 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法 测 定 红 豆 杉 植 物 和 细 胞 培 养 物 中 紫 杉 醇 的含 量
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中图分类号 ： ５７ １ ； ６７ ７ ｓ６ ． ９ ０ ５ ．
文献标识码 ：Ａ
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紫杉醇 （ ￣ｏ） Ｔ １是一种 新型 的抗癌 药物 。由于紫杉 醇在 红豆 杉属（ 删 ｌ Ｌ） 物 中的含 量根 低 ， 且运 用植物 细胞 植 而 培养技术生产紫 杉醇仍 处实 验阶段 ， 因此 ， 对于 紫杉醇 含量 甚微的样品 ， 寻找 一种精 确 、 灵敏 、 速的检 测方法就显得 尤 快 为重要 。本实 验 采用 改进 的 ｔ Ｌ ｔ Ｃ法 对 南方 红豆 杉 ［ 肌 Ｐ Ⅱ ｖｒ ｅ－ ｋ哪葩ｅ ｄ． 即ｇｅ Ｌ Ｆ ］ 和 丑．ｍ Ｚ ／（ ｅ Ｉ ）０Ｉ 【 ．Ｋ ｕ 枝 叶， 以及 中国红豆杉 【 ｚ ｒ 帆 （ 即）Ｋ Ｉ ．细胞培 养 瑚日 ｅｄ ］ Ｉ 物 中的紫杉醇含量进行 了测定 。
Ｉ 实验 方法
１１ 实验 材 料 ．
渡 ５ｍ１直接加 ５ｍ ． ， Ｌ二氰 甲烷萃取 ３ ， 次 收集二氯 甲烷溶液
紫杉醇的人工合成方法
紫杉醇的人工合成方法:1 植物组织培养植物组织培养利用植物细胞全能性，可利用红豆杉植株嫩茎、针叶、树皮、形成层、假种皮、胚等作为外植体进行培养，从而形成大量的提取原料。
目前国内外有很多报道，取得了显著成果。
2 微生物生产Stierle等从短叶红豆杉韧皮部分离到一种寄生真菌（Taxomyces andreanae）可以在特定的培养基中产生紫杉醇及其相关经合物，但由于目前产量极低，还未能在生产中得到应用。
通过改变培养条件和应用重组DNA技术，可望提高紫杉醇的产量。
由于根是除树皮外紫杉醇含量较高的器官，人们利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染红豆杉植物外植体诱导生根，通过此培养系统进行紫杉醇生产的尝试，因为这一培养系统无需外援激素、发根生产迅速、遗传性状稳定而受到重视。
积极寻找能合成紫杉醇或其类似的微生物，从微生物的合成途径中定位关键酶和克隆相关基因，将比对植物的研究有更大的意义。
3 使用生物工程法来合成利用生物工程的方法大规模生产紫杉醇是使用生物工程手段，培育、筛选出可大量产生紫杉醇的菌株，通过对它们不断地扩充培养，实现在培养基里“无限制地”生产紫杉醇，而无须再去砍伐自然界已所剩无几的红豆杉树。
实例目前已从一棵百年红豆杉的树皮中分离、筛选出一株紫杉醇产生量十分可观的菌种，命名为HQD33，然后利用化学、物理等多种方法多次诱变、优化其基因结构，再利用生物工程的手段进行处理，最终培育构建出在每升培养液中可产出448.52微克紫杉醇的高产菌株。
4 人工半合成为了保护紫杉树珍贵的资源，避免大量采集紫杉树树皮造成资源破坏，应将目标瞄向了利用可再生资源进行紫杉醇的生产。
百时美施贵宝公司在充分保证泰素产品质量的前提下，1994年，他们成功地利用紫杉树的细枝、叶等可再生材料，提取初级原料，再人工半合成生产紫杉醇。
其半合成生产方法获得了美国FDA 的批准。
从此，太平洋紫杉树不再被破坏性采集，泰素的持续生产供应也得到了保障。
高效液相色谱法测定红豆杉枝叶中紫杉醇的含量
高效液相色谱法测定红豆杉枝叶中紫杉醇的含量【摘要】目的研究红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定方法，并对人工种植的云南红豆杉中紫杉醇的含量进行调查研究。
方法采用甲醇和二氯甲烷超声提取样品，HPLC梯度洗脱。
结果紫杉醇的理论塔板数为5628，分离度为1.42，拖尾因子为1.01。
回归方程为Y=4×107X+39 942，r=0.999 7，在0.004 2～0.020 1/ml之间的线性关系良好。
日内和日间精密度的RSD均小于2.0%，重复性实验的RSD为0.3%（n=5)，最低检测限为1.0μg/ml，加样回收率为85.19%，84.95%，82.37%，RSD（n=5)分别为3.7%，4.87%，3.6%。
人工种植的云南红豆杉中紫杉醇的平均含量达140mg/kg。
结论该方法缩减了红豆杉药材的前处理步骤，节约了实验时间，适用于红豆杉枝叶中紫杉醇含量测定；同时也证明中国思茅地区人工种植的红豆杉具备提取紫杉醇的价值，有较高的开发利用价值。
【关键词】红豆杉紫杉醇高效液相色谱法Abstract：ObjectiveTo develop a method for measurement of paclitaxel in the taxus from Yunnan Province. MethodsThe medicinal plants was extracted with ethanol and dichloromethane. ResultsThe theoretical plate number of paclitaxel was 5628， the resolution was 1.42 and the tailing factor was 1. 01. The calibration curve was linear in the range of 0.004 2～0.020 1 mg/ml，Y= 4×107 X+39 942， R=0.9997. The intra-day and inter-day precision (RSD) were all less than 2.0%， the recurrence (RSD) was 0.3% (n= 5). The limit of detection was 1.0 μg/ml，the recovery rate was 85.19%，84.95%，82.37% and RSD was 3.7%，4.87%，3.6% (n=5) respectively for paclitaxel. ConclusionOur developed method can shorten the time used for pretreatment， and is a simple and reliable method to determine the content of paclitaxel in taxus. The results also prove that the quality of yew in Yunnan Province is relatively good.Key words：Taxus; Paclitaxel; High-performance liquid chromatography红豆杉属(Taxus spp)植物起源古老，属第三纪孓遗植物，在地球上已生存繁衍250万年，且地理分布区域广泛［1］。
红豆杉的研究
红豆杉的研究，药用价值明显1971年美国化学家从知叶红豆衫Taxus breuifilia 树皮中分离出高抗癌活性紫杉烷二萜化合物“紫杉醇”，发现“紫杉醇”具有独特的抗肿瘤作用，它能与微管蛋白质结合，形成稳定的稳管束，并使被解聚，将癌细胞停止在G2晚期或M期，抑制细胞复制，阻止癌细胞z增殖，（用通俗的话说：“就是目前唯一能控制癌细胞生长的植物药”），这一奇特的功效引起了NCI（美国国立癌研究所）的高度重视，促进了临床试验的工作进行。
我国于80年代末组织专家开始了紫杉醇及红豆杉成份的深入研究。
1995年中国医学科学院药物。
所以国产云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉等5种植物中成功研制出纯度达98%以上的紫杉醇原料，北京协和药厂和海口市制药厂分别研制成紫杉醇注射液（商品名为紫素和特素），并已被批准为国家二类新药，经京、津、沪等地医院临床试验证实国产紫杉醇注射液的疗效与国外文献报道相当，价格却比进口同类药物低50%左右。
国际上，在1989年完成了紫杉醇临床试验Ⅰ、Ⅱ期的临床，1990年进行Ⅲ期临床，1991年NCI与美国百时美施贵宝（BMS）签署合作研制协议，1992年NCI将紫杉醇转让给百时美施贵宝。
1992年12月29日美国FDA正式批准其作为晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌等的治疗药物上市，之后施贵宝的紫杉醇在美国、加拿大获准上市。
该药从申报到批准只用了5个月时间，创造了美国新药审批时间最短记录。
紫杉醇的上市立即成为全球性最热点的抗癌新药，被誉为近15年来发现的最主要的抗癌药物。
美国百时美施贵宝（BMS）公司因生产“紫杉醇”针剂，几年来销售额已接近美国烟草行业总销售额，每年已达60亿美元，超出了预测的数字。
到目前为止全世界已有40多个国家应用“紫杉醇”。
紫杉醇在美国向来是施贵宝的独家产品，1998年紫杉醇在美国获得与顺铂联用治疗卵巢癌。
但近年来形势发生了变化，美国FDA已于2000年10月同意其它厂家亦可生产紫杉醇制剂（作为通用名药上市）。
紫杉醇的分离与纯化
摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。
方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。
结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。
关键词红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶目录一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。
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（一）液相萃取。
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（二）固相萃取法。
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（三）树脂层析法。
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（四）活性炭脱色。
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（五）硅胶正向层析。
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（六）结晶纯化。
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