红豆杉细胞培养与紫杉醇生产(一)
高中生物 第二章 课时7 植物细胞工程课后作业(含解析)苏教版高二选修3生物试题
第7课时 植物细胞工程目标导航 1.掌握植物组织培养的原理、过程及其特点。
2.理解人工种子的制备方法、过程及其意义。
3.理解植物细胞培养的方法、过程。
4.举例说出植物细胞工程的应用。
一、植物组织培养1．细胞的全能性(1)概念：生物体细胞在________________上存在很大差异，但每一个细胞都具有该物种的__________________________，都具有____________________________________，也就是说，每个细胞都具有________________________的潜能。
(2)证据：植物的体细胞在适宜的条件下可培养成________________。
2．植物组织培养(1)概念：是指依据______________原理，在________条件下，分离植物的____________________________(外植体)，并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成________________的技术。
(2)培养材料：________________________等。
(3)培养过程离体的植物器官、组织或细胞或原生质体――→脱分化____________――→再分化______或________―→试管苗①愈伤组织：是一团没有__________________并处于____________状态的______细胞。
②脱分化：指____________的植物细胞形成______________________的过程。
③再分化：____________重新被诱导分化形成______等器官的过程。
(4)人工种子①概念：是指在________________中得到的________________，包埋在含有营养和保护物质的包被中，在适宜条件下能够____________的颗粒体。
②结构：________外包裹__________和__________。
二、植物细胞培养1．概念：将组织培养过程中形成的____________或其他易分散的组织置于__________中，进行__________，得到分散游离的悬浮细胞，通过____________使细胞增殖，从而获得大量的____________的一种技术。
紫杉醇生产工艺
6.1 概述 6.2 紫杉醇半合成工艺过程与质量控制
1
6.1 概 述
（一）紫杉醇简介 （二）紫杉醇的生产工艺路线
2
紫杉醇
简介
O
O O OH
苯 基 异 丝 氨 酸
10
*
7*
B *C
O NH O
A
*
* 13 1 * *
H
4 *
*
5
O
* 2' *
O
OH O O
HO
OO
11个手性中心 紫杉醇 Taxol 三环二萜核
20（Leabharlann ）基础四元环的制备[2+2]型环加成反应：乙酰氧基乙酰氯在三乙 胺作用下脱HCl生成烯酮，烯酮与亚胺反应得 单一顺式异构体。
21
（3）基础四元环的制备
产物的立体构型取决于亚胺上取代基的类型。 取代基为芳基、芳杂环、共轭烯烃时，环加成 产物为顺式。
22
（4）氧化四元环的制备
cis-3-乙酰氧基-4-苯基-2-吖叮啶酮
乙氧乙氧基
28
（6）硅化四元环的制备
保护剂乙烯基乙醚与羟基的亲电加成机理
H
OC2H5 + H+
CC
H
H
H + OC2H5 HCC
HH
Ph NH
+
H HO
O
H C C OC2H5
HH
Ph NH
-H
HO
O
H C C OC2H5
HH
➢ 需保持反应体系的单一性，防止其他具有较强
3
紫杉醇
简介
HO O OH
O
O NH O
《紫杉醇的生物合成》课件
02
紫杉醇生物合成途径
前体物质的合成
葡萄糖磷酸化
葡萄糖在己糖激酶的催化下磷酸化生成6-磷酸葡萄糖。
磷酸戊糖途径
6-磷酸葡萄糖在磷酸戊糖异构酶的作用下生成5-磷酸核酮糖，再经过一系列反 应生成5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖。
紫杉二烯的合成
甲羟戊酸途径：5-磷酸木酮糖在酮糖 基转移酶的催化下生成4-丙二醇焦磷 酸，再经过一系列反应生成法呢烯焦 磷酸，最后生成牻牛儿基牻牛儿酯。
紫杉二烯合成酶
负责将前体物质转化为紫杉二烯，是紫杉醇生物合成的关键酶之一。
基因克隆与鉴定
通过基因克隆和鉴定，了解紫杉二烯合成酶的结构和功能，为人工合成紫杉醇提 供理论依据。
紫杉醇合成酶与基因
紫杉醇合成酶
负责将紫杉二烯进一步转化为紫杉醇，是紫杉醇生物合成的最后一步。
酶活性调节
研究紫杉醇合成酶的活性调节机制，探索如何提高紫杉醇的产量。
牻牛儿基牻牛儿酯在细胞色素P450酶 系的作用下生成紫杉二烯。
紫杉醇的合成
01
紫杉二烯在细胞色素P450酶系的 作用下生成5α-柯巴基焦磷酸，再 经过一系列反应生成巴卡亭Ⅲ。
02
巴卡亭Ⅲ在巴卡亭酶的作用下生 成巴卡亭Ⅳ，再经过一系列反应 生成紫杉醇。
紫杉醇的修饰与转运
紫杉醇在细胞色素P450酶系的作用下经过氧化、还原、水解等反应生成多种具有抗癌活性的代谢产 物。
代谢工程
对微生物的代谢网络进行改造，优化紫杉醇的合成途径。
利用合成生物学技术构建紫杉醇生产菌株
构建基因编辑工具
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对紫杉醇生产菌株的精 准编辑。
构建高产菌株
通过基因工程技术，将紫杉醇合成相关基因导入到高产菌株中，构 建出具有高生产能力的紫杉醇生产菌株。
紫杉醇
紫杉醇1.紫杉醇的发现和历史2.紫杉醇的化学结构3.紫杉醇的提取分离方法4.紫杉醇的合成研究5.常见的几种紫杉醇药物6.个人感想1.紫杉醇的发现和历史紫杉醇是红豆杉科红豆杉属植物的次生代谢产物，这类植物主要分布于北半球的温带至亚热带地区，全世界共有11种。
最初，紫杉醇是从短叶紫杉（Taxus brevi folia）的树皮中分离获得的，在它的抗癌作用被发现之前，林木工人通常把它砍了当柴烧或者用来做篱笆。
早在1856年德国科学家Lucas·H开始对Taxus baccata Linn(浆果红豆杉)进行化学研究，并从其叶片中提取出粉状碱性成分Taxine,但在随后的100多年里没有多大的研究进展。
直到20世纪60年代，随着光谱技术的飞速发展，科学家才开始对红豆杉属的植物有了比较深入的研究。
20世纪初，人们发现美国西部山区的一个有一片红豆杉林的小城镇中的居民很长寿，他们的寿命最短的在95岁以上，绝大多数的人寿命超过100岁，而且百岁老人随处可见。
科学家到那里考察发现当地居民除了两个与其他地方居民不同的生活习惯外，其余的都差不多。
一是当地居民喜欢采摘山林中的红豆杉树叶泡茶喝；二是经常去红豆杉林中散步或运动。
这种现象引起了科学家对红豆杉的研究兴趣，他们从红豆杉树皮中提取出一种对许多类型的肿瘤细胞有细胞毒作用的提取物——紫杉醇。
后来研究表明其化学结构为紫杉烷类中的一种四环二萜类化合物【1】。
1962年8月，在美国农业部任职的植物学家Barclay响应由美国国立癌症研究所（National Cancer Institute ,NCI）发起的植物提取物抗癌活性成分筛选研究,收集了7Kg太平洋紫杉的树皮寄回了NCI。
这些样品后来经NCI北卡罗莱纳州“研究三角学院”（Research Triangle Institute ,RTI）分馏实验室的美国化学家Wani博士和Wall博士。
他们分离提取得到紫杉醇的粗提物，在筛选实验中他们发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的抑制活性，有强烈的KB细胞毒作用及抗小鼠肉瘤和抗白血病活性。
紫杉醇培训资料
紫杉醇的提取和纯化
提取方法
采用合适的提取方法，如有机溶 剂萃取、高速离心等，以最大程 度地提取紫杉醇。
纯化技术
采用色谱技术、沉淀技术、蒸馏 等纯化技术，使紫杉醇的纯度达 到药典要求。
产品质量控制
在提取和纯化过程中，需严格控 制产品质量，确保紫杉醇的安全 性和有效性。
紫杉醇的生产现状和发展趋势
生产现状
目前紫杉醇的生产主要依赖于植物提取，但存在资源有限、生产成本高等问题。
发展趋势
为解决这些问题，国内外研究者正积极探索基因工程、细胞培养等新型生产方法，以提高紫杉醇的生产效率和 降低成本。
03
紫杉醇的药理学性质
紫杉醇的药物动力学特性
吸收和分布
紫杉醇口服吸收率较低，主要通过静脉注 射给药。药物在体内广泛分布，主要分布 于肺部、肝脏、肾脏和胃肠道等器官。
醇的作用机制不同。
协同作用
02
紫杉醇和其他新型抗肿瘤药物联合应用，可发挥协同作用，提
高抗肿瘤效果。
临床应用
03
在多种肺癌、结直肠癌、黑色素瘤等的治疗中，紫杉醇与其他
新型抗肿瘤药物联合应用已取得较好的疗效。
06
紫杉醇的未来研究和开发前景
紫杉醇新型作用机制的研究
紫杉醇抗肿瘤机制的深入探讨
研究紫杉醇如何影响肿瘤细胞的生长、分裂和死亡过程，以及其对这些过程的精确作用机制。
紫杉醇的毒性和不良反应
毒性反应
紫杉醇的毒性反应主要包括骨髓抑制、过敏 反应、心脏毒性等。骨髓抑制主要表现为白 细胞和血小板减少，过敏反应表现为皮疹、 呼吸困难等，心脏毒性表现为心肌损伤、心 律失常等。
不良反应
紫杉醇的不良反应包括恶心、呕吐、脱发等 ，这些不良反应会影响患者的治疗依从性和
紫杉醇
紫杉醇紫杉醇，白色结晶体粉末。
无臭，无味，难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等有机溶剂。
主要以红豆杉为原料的提取物，【从紫杉醇产生菌中提取，化学合成法,利用红豆杉细胞培养生产】英文名称Paclitaxel[,pækli'tæksəl]，别名泰素，紫素，特素，化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2R，3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量853.92，分子式C47H51NO14。
药理作用机制：紫杉醇可使微管蛋白【组成微管的蛋白质】和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配，防止解聚，使微管【一种具有极性的细胞骨架，微管的功能：维持细胞形态，辅助细胞内运输，与其他蛋白共同装配成纺锤体，基粒，中心粒，鞭毛，纤毛神经管等结构】稳定，从而阻止癌细胞的生长。
紫杉醇的衍生物：多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物，生物利用度好，毒副作用小。
紫杉醇的应用：紫杉醇是目前国际上抗癌效果最好，广谱性强，副作用较小，是作用机制全新的一种理想抗癌药物，主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。
目前应用相对比较成熟的有以下一些方面：1.在治疗卵巢癌方面，紫杉醇早已经是卵巢癌治疗得到首选药物了。
经过了许多临床试验表明，不管是单一使用还是联合用药，都远好于传统化疗法治疗这种癌症。
紫杉醇还可联合顺铂治疗晚期卵巢癌,紫杉醇是一种新型的具有抗微管作用的抗肿瘤药物。
2.在治疗子宫颈癌方面，紫杉醇的地位没有像治疗卵巢癌那么重要，但是随着紫杉醇在这方面的应用的增加，它的地位也日显重要。
在子宫颈癌治疗的研究有三方面：对于局限性晚期宫颈癌的先期化疗应用，晚期或复发性病例的治疗以及放射治疗的增敏。
3.在治疗乳腺癌方面，紫杉醇的药效相对较高，单药效大于一半，在治疗此类的药物中药效算是较好的一种。
红豆杉细胞组织培养等技术的综述
红豆杉细胞组织培养等相关技术的综述摘要红豆杉因其次生代谢产物紫杉醇具有独特的抗癌活性，而倍受关注[1，2]，目前研究较多的是用细胞组织培养技术生产红豆杉获取紫杉醇，而且研究者对其相关技术条件进行了不断的摸索与优化，本文主要对近10年的红豆杉细胞组织培养技术相关内容进行综述。
关键词红豆杉；紫杉醇；细胞培养；优化1、介绍红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，是第四世纪冰川后迄今为止仅有的56种植物中的珍稀药用树种之一。
全世界共14种，我国有4种和1变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉[1]。
红豆杉产生的二萜类次生代谢产物-紫杉醇是当今世界公认的广谱、高活性抗癌药物，具有独特的抗癌机理，因此红豆杉倍受关注[1，2]。
紫杉醇对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效，它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药[3]。
但天然红豆杉树皮中紫杉醇含量极低，仅为干重的0．01％一0．06％，3～6棵100年左右的红豆杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫杉醇[4]，由此也出现了药用和资源保护的尖锐矛盾[5]，可见单纯靠天然生长的红豆杉树中提取的紫杉醇远远不能满足需求，药源不足已成为限制紫杉醇在临床中大量应用的瓶颈[3，4]。
解决药源的问题的方法说来应该就两个大方面，即人工合成和生物技术方法，也就是化学合成和利用相关生物技术解决紫杉醇的药源问题。
但是，由于紫杉醇化学结构的复杂性，这就意味着紫杉醇的化学合成在经济上是不可行的；而且紫杉醇的半合成原料，例如从针叶红豆杉所分离得到的巴卡亭Ⅲ，也要从红豆杉属植物中提取获得[6]。
这样看来，人工合成的方法，不论是全化学合成还是半化学合成，其可行性都很低。
从生物技术角度来看，人们主要从遗传转化、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等几个方面尝试解决紫杉醇的药源问题，而其中的细胞培养因具有众多优点而成为商业化生产的首选方法[5]。
紫杉醇的分离与纯化
摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。
方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。
结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。
关键词红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶目录一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。
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（二）固相萃取法。
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（三）树脂层析法。
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（四）活性炭脱色。
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（五）硅胶正向层析。
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（六）结晶纯化。
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对于红豆杉细胞培养中常遇的褐变现象，在培 养基中加入具有抗氧化和抑制多酚氧化酶活性 的植酸，可控制细胞褐变，延缓细胞衰老，促 进细胞生长，效果较好。
除此之外，培养基中加入某些前体物质，使用 条件培养液，以及某些激素与条件培养液的协 同作用，均使紫杉醇的产量有显著提高。
红豆杉细胞培养生产紫杉醇的 研究
演讲人：XXX 2008.11.06
该文从培养基组成、培养条件、培养基中不同 添加物对红豆杉细胞培养和细胞中紫杉醇产量 的影响,以及在提高紫杉醇产量中有关酶代谢 调节、细胞株系选择和培养方法的改进等方面, 着重介绍了近几年来的研究成果。
植物细胞培养
植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的植 物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果 实种子等）、组织（如形成层、花药组织、胚 乳、皮层等）、细胞（如体细胞、生殖细胞 等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质 体（如脱壁后仍具有生活力的原生质体），培 养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条 件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或成长完 整的植株，统称为植物细胞培养技术。将诱导 形成的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养
(3)所得产物比从植物体内直接提取简单，可以 大大简化分离和纯化步骤。
(4)除提供紫杉醇外，还可以生产出前体及其他 有抗癌活性而原植物所不含的化合物。
细胞培养生产紫杉醇的方法研究
1.培养基的组成
培养物生物量的增加是获得代谢产物的前提,除 通常使用的B5培养基外，对于不同种的红豆杉 培养基需摸索最适的培养基。用包含B5的大量 元素和复杂的维生素混合成分的TM5培养基可 使愈伤组织比以前报道的培养基生长速度提高 4.3倍。
有报道称用一种改良的WR培养基，愈伤 组织生长增长5.8倍。在培养基中单独使 用硝酸盐作为N源比单独使用铵盐要好， 降低N或P的浓度抑制细胞的生长，但可 促进紫杉醇的产生。
单独使用某些氨基酸可以起到特殊效果，而某 些氨基酸与激素一起使用效果却不佳.例如：用 5mg/L IAA-苯丙氨酸可使紫杉醇的含量提高到 0.05在培养基中加入2,4-D与IAA-苯 丙氨酸，却没有效果。有机添加物如椰子汁、
寻找更有效的新的生产紫杉醇途径，成为许多 国家研究的热点.利用细胞工程学方法，生产紫 杉醇及其具有同样抗癌活性的类似物，不仅可 弥补红豆杉资源的不足，而且也可以保护红豆 杉的野生资源及其生存的生态环境，因此该方 面的研究吸引了许多研究者的注意。
从1991年Christen等获得通过红豆杉细胞培养 提取紫杉醇的第一个专利以来，细胞工程学在 此方面的研究日益深入。已有许多较全面的综 述性文章从紫杉醇培养物的建立到大规模培养
紫杉醇作为人们从植物天然产物中搜寻到的最
有效的抗癌药物之一，它能与微管蛋白结合并 促进其聚合，抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细 胞的增殖，具有明显的抗白血病、肺癌、卵巢 癌、乳腺癌的作用。紫杉醇最初是从短叶红豆 杉树皮中分离得到的，仅乳腺癌病人每年所需 要的紫杉醇大约为25 kg，而获得1g紫杉醇需 要3~6棵短叶红豆杉，我国云南的红豆杉正因 此而几近灭绝。
称为悬浮培养。
紫杉醇的介绍
紫杉醇是70年代首次从短叶红豆杉树皮中分离 到的具有抗癌活性的二枯烯类化合物。后证实， 紫杉醇具有特殊的抗癌机理，它能与微管蛋白 结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂， 阻止癌细胞的增殖。作为新型的抗癌药物，紫 杉醇不仅对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的作 用，近年来，临床研究表明紫杉醇对其他疾病 治疗也有一定潜力，如类风湿性关节炎、早老 性痴呆和先天性多囊肾病等，因此紫杉醇日益 成为许多国家研究的热点。
及含量检测等方面进行了论述。
为解决紫杉醇的药源问题，人们从以下几个方 面进行了研究:全合成、半合成、人工栽培、真 菌生产和植物细胞培养等方法。其中细胞培养 法由于具有下述优点成为人们进行商业生产的 优选方法:
(l)能够确保产物无限、连续、均匀地生产，不 易遭受病虫害、季节等因素的影响。
(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并且 通过控制环境条件提高紫杉醇产量。
其他条件
培养温度对红豆杉细胞生长及紫杉醇的合成， 发现在24℃培养一段时间后，升高温度到29℃， 14~21 d后，紫杉醇含量可达137mg/L的最大 值，如果21d后仍持续保持29℃，紫杉醇含量 可在这一峰值保持42d。由此可见，温度与紫 杉醇合成途径之间有明显的相关性
光对细胞培养物影响研究较多，普遍认为，黑 暗条件对细胞的生长与紫杉醇合成都较有利， 生长量与含量均能比光培养条件下提高3倍左 右。