红豆杉细胞组织培养等技术的综述

红豆杉细胞组织培养等相关技术的综述摘要红豆杉因其次生代谢产物紫杉醇具有独特的抗癌活性，而倍受关注[1，2]，目前研究较多的是用细胞组织培养技术生产红豆杉获取紫杉醇，而且研究者对其相关技术条件进行了不断的摸索与优化，本文主要对近10年的红豆杉细胞组织培养技术相关内容进行综述。

关键词红豆杉；紫杉醇；细胞培养；优化1、介绍红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，是第四世纪冰川后迄今为止仅有的56种植物中的珍稀药用树种之一。

全世界共14种，我国有4种和1变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉[1]。

红豆杉产生的二萜类次生代谢产物-紫杉醇是当今世界公认的广谱、高活性抗癌药物，具有独特的抗癌机理，因此红豆杉倍受关注[1，2]。

紫杉醇对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效，它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药[3]。

但天然红豆杉树皮中紫杉醇含量极低，仅为干重的0．01％一0．06％，3～6棵100年左右的红豆杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫杉醇[4]，由此也出现了药用和资源保护的尖锐矛盾[5]，可见单纯靠天然生长的红豆杉树中提取的紫杉醇远远不能满足需求，药源不足已成为限制紫杉醇在临床中大量应用的瓶颈[3，4]。

解决药源的问题的方法说来应该就两个大方面，即人工合成和生物技术方法，也就是化学合成和利用相关生物技术解决紫杉醇的药源问题。

但是，由于紫杉醇化学结构的复杂性，这就意味着紫杉醇的化学合成在经济上是不可行的；而且紫杉醇的半合成原料，例如从针叶红豆杉所分离得到的巴卡亭Ⅲ，也要从红豆杉属植物中提取获得[6]。

这样看来，人工合成的方法，不论是全化学合成还是半化学合成，其可行性都很低。

从生物技术角度来看，人们主要从遗传转化、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等几个方面尝试解决紫杉醇的药源问题，而其中的细胞培养因具有众多优点而成为商业化生产的首选方法[5]。

本文主要从红豆杉细胞组织培养等生物技术角度，对近10年其培养过程、培养条件及其优化等方面进行综述。

2、红豆杉细胞培养技术红豆杉细胞培养的首要考虑应该是外植体的选择，这是对紫杉醇的产生具有质的影响的关键因素。

此外还得考虑培养基及培养条件和方式等的影响，下面就从红豆杉细胞培养技术的一般过程加以说明。

⑴外植体的选择红豆杉为裸子植物，不同种的红豆杉或不同的器官、组织、生长部位等外植体的诱导能力不尽相同，所需的培养基及培养条件有很大的差异，其愈伤组织诱导比较困难，生长也较缓慢[4，5]。

现在，人们已从各种不同的红豆杉的不同外植体如针叶、幼茎、树皮、形成层、种胚及假种皮等诱导出愈伤组织，其中以幼茎为最好的来源[5]。

但是，对于不同种属的红豆杉则有不同优选的外植体，如东北红豆杉幼茎、短叶红豆杉的树皮或形成层则分别是最佳的外植体[4]。

另有实验发现，以紫杉醇含量高的外植体作为诱导材料，可获得紫杉醇产量高的细胞系。

云南红豆杉和中国红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量较高，是获得紫杉醇高产愈伤组织系的外植体的较佳来源［3］。

⑵培养基的选择对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养，多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5培养基，然而也有不同的研究结果报道。

翟雪霞[7]等通过研究比较三种不同的培养基，表明以太行山原始中国红豆杉的1-2年生嫩枝和幼叶为外植体材料时，B5培养基的诱导效果最好，其具有诱导率高，出愈时间早，愈伤组织块大，色浅，质地疏松和生长快等优点，在后续培养中发现其是建立细胞系的质量最好的类型。

而MS和WPS培养基诱导出的愈伤组织颜色较深，生长较慢，但质地致密，有胚性化趋向。

另有研究[3]以南方红豆杉芽为外植体时，发现最适诱导的培养基为MS；对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5为最佳。

也有南方红豆杉愈伤组织在TA培养基上生长明显优于B5培养基的报道[3]。

由此可见，对于来源不同甚至相同的红豆杉，其外植体其最适培养基必须亲自经过多次的摸索研究方能定夺，前人的研究成果只能作为参考依据。

另外由于培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养及紫杉醇的合成与积累起着重要作用[3，8]，故而培养基中还需加入比例合适的各种激素。

⑶培养方式和条件的确定培养过程涉及植物组织的脱分化、愈伤组织的诱导及继代与细胞悬浮培养 [9，10]等。

愈伤组织的诱导黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成，紫杉醇的产量高于光照条件下的3倍 [3，7]。

培养方式一般为固体培养，也有研究者为了缩短从诱导到悬浮培养的生长周期而采用液体悬浮培养[5，10]。

愈伤组织继代与细胞悬浮培养翟雪霞[7]等研究中国红豆杉时，发现液体培养、半固体培养和纸桥培养等3种培养方式的细胞生长率差异显著，其中以纸桥培养的生长率最高，认为纸桥培养是红豆杉愈伤组织繁殖继代和增殖的一种良好方法。

他们还发现光照和温度也是影响细胞生长的重要因素，就其结果来看，红豆杉细胞系适宜的生长温度为24℃左右，温度过高时细胞生长速率下降，褐化明显加快。

此外光照不仅影响愈伤组织的增长率，还对细胞形态分化有作用，与有光条件相比，黑暗条件下愈伤组织生长迅速，新形成的愈伤组织色浅且疏松，适合继代。

和愈伤组织相比，悬浮培养的细胞因与液体培养基充分接触，养分供给充分，细胞生长周期短，细胞生物量增加快，成为了植物细胞培养主要的方式；此外尚有可连续培养、反应效率高、易于调控的固定化培养，以及两相法和两步法等[3]。

在悬浮培养过程中应随时注意愈伤组织、细胞团生长的情况，挑选生长速度最快和特征最好的作为继代的材料，这样经过几代的选择，就可以挑出符合理想的材料，作为悬浮系进行扩增培养[9]。

⑷紫杉醇含量的测定紫杉醇含量的测定，可以在培养的不同时期加以测定，若在愈伤组织诱导期加以测定，可以确定合适的诱导条件；若在细胞悬浮与继代培养过程中进行测定，可以进行材料的筛选，获得理想的材料。

总之，在不同时期对培养物中目标含量进行测定，可以促进细胞培养过程的不断优化，对获得高产和稳产的细胞系具有重大意义。

例如李志良[11]等应用电导率监测红豆杉细胞悬浮培养中细胞生长与紫杉醇的累积情况，实验表明，细胞生长和紫杉醇累积曲线与培养液的电导率曲线恰成镜像相关，由此说明，通过测得培养液的电导率数值变化可以判断细胞生长状态和是否到达细胞生长高峰、紫杉醇积累高峰。

3、细胞组织培养过程的优化和对相关问题的探索综合来看，培养过程的优化不外乎培养基及培养条件的优化和所用外植体材料的优化两大方面。

总的说来，培养基及培养条件的优化方法又可分为物理和化学两种方式进行优化，物理的方法又包括超声波，磁场处理等，化学的方法主要是添加额外的化学物质来改进培养过程。

举例说明如下：⑴培养基及培养条件的优化物理方法例如张姝[12]等分析了超声波对中国红豆杉悬浮细胞培养的生长、紫杉醇合成及释放的影响，研究发现细胞对不同强度及作用时间的超声波反应不同：用38kHz，120s的超声强度处理悬浮细胞，紫杉醇胞外释放率由对照的10%左右提高到40%-50%，总产量提高了47%。

研究人员分析认为超声对红豆杉悬浮细胞培养紫杉醇生产的影响可以从以下几个角度研究或解释：超声可导致细胞内的氧自由基的形成；细胞内酶和底物的区域化也可因超声引起变化，部分酶促反应可得到激活；超声的热效应也有可能会影响植物细胞的主次代谢。

化学方法（含生物提取物）例如陈正山[13]在改良的B5培养基中加入不同浓度的聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞进行摇瓶培养，通过不同时期的测定发现，聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产均有明显的促进作用。

聚乙二醇为20g/L时，对紫杉醇的生产最有利，最后所得紫杉醇含量是不加聚乙二醇的11倍。

还有就是对培养基中加入的不同的生物或化学诱导子对紫杉醇产量的影响的研究，发现不同的物质具有不同的作用机理[14，15，16]。

也有研究物理和化学因素共同作用对紫杉醇产量影响的成果报道。

如范寰[17]等研究了电磁场对水杨酸诱导下悬浮培养的南方红豆杉细胞的生长和紫杉醇产量的影响。

他们发现，在磁场强度为3.5mT的直流稳恒磁场下细胞活力、生物量和胞内蛋白含量均有明显升高；磁场作用后紫杉醇的产量第2天出现大量累积，最高产量出现在第6天，比水杨酸单独处理组提前2天，但产量有所降低。

他们认为尽管所采用的磁场强度、作用时间下，磁场并没有提高紫杉醇产量，但对紫杉醇产量的影响是非常显著的。

我认为如果他们多设置几个磁场梯度，或多设置几个实验组和对照组，包括有和无水杨酸的不同磁场强度的几个实验组和对照组。

进行这样的实验之后，就可以获得不同磁场强度对紫杉醇产量的影响，以及磁场和水杨酸在影响紫杉醇产量方面的相互作用规律等。

培养条件方面罗杰[18]等采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响，并取得了相应的成果。

赵应征[19]等应用星点设计结合效应面法，优化了红豆杉细胞同步化条件，相比于国内文献报道的常用于筛选最佳工艺条件的均匀设计和正交设计优化法，此法很好地弥补了前两者的不足，最佳条件下效应的预测值和实测值偏差较小，结果较好。

⑵外植体材料的优化最基本的优化外植体的方法是对原有不同种红豆杉的筛选。

例如研究发现短叶红豆杉的紫杉醇含量比墨西哥红豆杉的高[20]；再如李志良[21]等通过对中国红豆杉、云南红豆杉和东北红豆杉不同部位的愈伤组织进行培养及分析比较结果表明，中国红豆杉愈伤组织生长较快，其叶片诱导的愈伤组织紫杉醇含量较高。

药用植物多倍体与二倍体相比具有根，茎，叶和花果的巨型性，抗逆性强，次生代谢产物含量提高等特性[22]。

李丽琴[22]等通过同步化培养和秋水仙素诱导处理，成功建立了红豆杉四倍体细胞系并证明了该细胞系的稳定性，进一步对其产物紫杉醇的检测，显示该四倍体细胞比对照二倍体细胞具有更高的合成紫杉醇的能力。

此外，也可利用基因工程技术提高紫杉醇含量，但这取决于两个条件：红豆杉遗传转化和植株再生体系的建立及红豆杉中与紫杉醇生物合成相关基因的克隆，目前这两方面的研究工作都取得了突破性进展[4]。

对红豆杉的遗传转化虽已有报道，但所用的转化受体都不是原生质体，可能由于红豆杉原生质体难以培养[23]，罗建平[23]等在成功地诱导原生质体持续分裂形成细胞克隆的基础上，将原生质体克隆与根癌农杆菌共培养，实现了T-DNA的转化。

研究结果为建立云南红豆杉由原生质体→细胞克隆→T-ＤＮＡ转化→单细胞起源的高产紫杉醇细胞系筛选体系奠定了基础。

⑶相关问题的探索在红豆杉组织及细胞培养过程中常常发生褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡，所以如何减轻和控制褐变的发生、发展，就成为红豆杉组织培养中重要的研究内容[24]。

红豆杉培养细胞发生褐变的原因复杂，与材料的基因型、生理状态、培养基成分及激素配比等因素有关。