放线菌的分离

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实验五：土壤中放线菌的分离
实验学时：5学时
实验类型：验证性实验、综合性实验
实验要求：必修

一、实验目的
从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容
筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约
有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在
比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土
壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料
中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜
碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉
菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，
它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，
常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的
数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方
法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，
本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确
定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤
纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段
原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；
原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不
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影响放线菌的生长。
四、实验组织运行要求
根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验
进行”的组织运行模式。

五、实验条件
试剂与仪器
试剂：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、
琼脂、盐酸、氢氧化钠、pH试纸、重铬酸钾
仪器：微波炉、电磁炉、干燥箱、玻璃涂铲、50或100mL量筒（灭菌）、
90mm培养皿（灭菌）、1或2mL移液管（灭菌）、标签纸、小玻璃珠（灭菌）、洗
耳球。
培养基：高氏1号合成培养基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4·3H2O
0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，pH:7.2—7.4，
琼脂20 g，水1000 mL，分装，高压湿热灭菌。
培养基制备过程（授课教师准备）：称取一定量可溶性淀粉，放入装有少量
水的小烧杯中，用玻棒将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加
热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次溶解。对微量成分
FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在10ml水中加入0.1g
的FeSO4·7H2O配成0.01g/ml母液，再在1000ml培养基中加入1ml的0．01g/ml
的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，调节pH、
分装、包扎、湿热灭菌。
土样：从校园各处采样。要求学生到不同生境、不同深度土壤中取样，如：
塘泥、森林、苗圃、路边菜园土或林地土，适量、自然风干，待用。

图1 稀释涂平板法示意图
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六、实验步骤
土样基本处理：每处理随机取不同土壤约100 g，自然条件下风干，颜色
由深变浅后碾碎，过孔径为840 μm（20目）的土壤筛（或人工挑取较大的石粒
或土块）。用无菌的报纸将土样包好（单层），放到电热鼓风干燥箱中，60℃干热
处理1h。（教师在课堂讲授前先指导学生完成该步骤的实验）
倒平板：将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热
溶解(视情况定加热时间，教师注意提醒学生掌握好加热的时间)、冷却后倒平板，
每皿约20 mL。待充分冷却后用于涂布。
称取待测样品10.0 g（盛放于灭菌纸中），放入装有90 mL无菌水的250 mL
三角瓶中，充分振荡10 min，即配成10-1稀释度的土悬液；用移液管量取1mL 稀
释度为10-1的土壤悬浮液于装有9mL无菌水的试管中，充分振荡，即配成10-2
稀释度的土壤悬浮液，按此法依次配成10-3，10-4稀释度的悬浮液。
用平板表面成菌落法测定土壤中微生物数量。将配好不同稀释度（10-2，
10-3，10-4）的菌悬液，用无菌移液管吸取0.2 mL土壤悬液接种在不同的稀释
度编号的平板上，每个处理重复2次，用无菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每
个稀释度用一个刮铲，如果从低浓度到高浓度涂布，可不用换刮铲。将涂好的平
板置于操作台面上20～30 min，使菌液充分渗透于培养内，然后将平板倒放，
置于28 ℃条件下恒温培养至长出菌落开始计数，观察。
每组在每个浓度两个平板分两种处理：一组无需向高氏一号培养基中加入0.5％ 重铬
酸钾溶液，直接置于微波炉中加热溶解、冷却后倒平板；另一组需向已加热溶解并冷却至
60℃高氏一号培养基中加入1.5 mL 0.5%重铬酸钾溶液，充分摇匀后倒平板。
七、思考题与作业
1. 不同生境土壤放线菌的多样性？（由授课教师指导全班同学共同完成这一
项作业）
2. 土壤中（湿重）放线菌的数量与培养特征描述。
3. 基于本次实验的基础，请设计一个从土壤中分离稀有放线菌的试验。（简要
说明即可）。
八、实验报告
按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、姓名、学号、实验目的、原
理、步骤、实验结果与记录、思考题、注意事项）
本实验还要记录实验条件、过程和实验现象。
九、注意事项
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添加重铬酸钾要适量；
注意涂平板的方法；
3天和5天后请记住观察实验结果
。

十、实验现象
1、土样基本处理：随机取不同土壤约100 g，自然条件下风干，颜色由深
变浅后碾碎，过孔径为840 μm（20目）的土壤筛（或人工挑取较大的石粒或土
块）。用无菌的报纸将土样包好（单层），放到电热鼓风干燥箱中，60℃干热处理
1h。

2、
倒平板：将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热
溶解(视情况定加热时间，教师注意提醒学生掌握好加热的时间)、冷却后倒平板，
每皿约20 mL。待充分冷却后用于涂布。

3、
称取待测样品10.0 g（盛放于灭菌纸中），放入装有90 mL无菌水的250 mL
三角瓶中，充分振荡10 min，即配成10-1稀释度的土悬液；用移液管量取1mL 稀
释度为10-1的土壤悬浮液于装有9mL无菌水的试管中，充分振荡，即配成10-2
稀释度的土壤悬浮液，按此法依次配成10-3，10-4稀释度的悬浮液。
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4、
将配好不同稀释度（10-2，10-3，10-4）的菌悬液，用无菌移液管吸取
0.2 mL土壤悬液接种在不同的稀释度编号的平板上，每个处理重复2次，用无
菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每个稀释度用一个刮铲，如果从低浓度到高浓
度涂布，可不用换刮铲。

5、
用平板表面成菌落法测定土壤中微生物数量。将涂好的平板置于操作台面
上20～30 min，使菌液充分渗透于培养内，然后将平板倒放，置于28 ℃条件下
恒温培养至长出菌落开始计数，观察。
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6、五天实验结果：