抑菌圈法实验流程
305-牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养,一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散,形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2。
2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅.2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器(20~200μL,100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2。
7试管：15×150 mm。
2。
8 酒精灯.2。
9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯.3。
病原菌、培养基及其他3。
1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌(乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3。
3 培养基:（1)大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
（2)金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
(3）沙门氏菌:营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4)乳酸菌：MRS肉汤。
（5)芽孢菌：营养肉汤.3。
4 其它：0.85％灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0。
30—0。
36之间, 则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备:（1)抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
如何使用牛津杯测定抗生素的抑菌圈
如何使用牛津杯测定抗生素的抑菌圈
目的：观察抗生素的抑菌效果，测定抗生素的抑菌圈大小，掌握牛津杯体外测定抗生素的抗菌性。
原理：抗生素从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗生素抗菌能力的强弱。
材料
1.菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18h得到的菌液。
2.药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3.器材：牛津杯、涂布棒、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5cm纸片、镊子、记号笔、尺子等。
实验步骤
1.按照培养基的配制方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20min后，放在60℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2.将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（10ug/ml,30ug/ml）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。
（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）
5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37℃下培养24h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
注意事项
1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
打孔法抑菌试验操作流程
打孔法抑菌试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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实验二几种抗生素的抑菌实验
抗生素合理使用建议
根据感染类型和病原体选择合适的抗生素
针对不同的感染类型和病原体，应选择相应的抗生素，避免滥用和误用。
避免长期使用或预防性使用抗生素
长期使用或预防性使用抗生素可能导致耐药性的产生，应严格控制使用。
注意抗生素的剂量和疗程
确保使用足够的剂量和适当的疗程，以提高疗效并减少耐药性的产生。
06
重复实验
为确保结果的准确性，需进行至少3 次重复实验。
数据记录与整理
数据记录
01
详细记录每次实验的抑菌圈大小、抗生素浓度等信息。
数据整理
02
将实验数据进行整理，计算平均值和标准差，并绘制抑菌圈大
小与抗生素浓度的关系图。
结果分析
03
根据实验数据，分析不同抗生素的抑菌效果，并比较其差异。
04
实验结果与分析
氨基糖苷类抗生素对革兰氏阴性菌具有较 强的抑菌效果，但对革兰氏阳性菌的抑菌 效果较弱。
不同抗生素抑菌特点比较
青霉素与头孢菌素
青霉素和头孢菌素均对革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果，但头孢菌素的抗菌谱更广，对革兰氏阴性菌也有较强的 抑菌作用。
大环内酯类与氨基糖苷类
大环内酯类主要针对革兰氏阳性菌，而氨基糖苷类则对革兰氏阴性菌具有较强的抑菌效果。
红霉素
大环内酯类抗生素，通过 抑制细菌蛋白质的合成来 杀死细菌。
细菌培养基
培养基是用于培养和繁殖细菌的物质，通常含有必要的营 养物质、生长因子和缓冲剂等。
选择适合实验所需细菌的培养基，以保证细菌的正常生长 和繁殖。
实验器材：培养皿、显微镜、移液器等
培养皿
用于培养细菌的圆形或方 形平皿，具有盖子以保持 无菌环境。
抗生素溶液制备
抑菌试验PPT课件
5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津 杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。
6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的 药液或待检样品。
7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。
8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 考表的标准判读结果，按敏感（S）、中介 （I）、耐药（R）报
牛津杯
“牛津杯”是放被测抗生素的不锈钢小管， 小管内径为6mm，外径为8mm，高 10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能 相等。
三、实验操作
1. 倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完 全融化，倒在培养皿内，每皿约20ml，凝 固。
2. 标记：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度
3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内的菌 苔并稀释。
注意事项
在超净工作台中或酒精灯旁操作 平板倒好，一定要平 牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀
的向四周扩散 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适
中，防止出现抑制圈重叠，可在平皿中央 摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
药敏试验
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是 指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验， 测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制 作用，以指导选择治疗药物和了解区域内 常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治 疗选药
二、实验材料
培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 菌种：
大肠杆菌（E.coli) 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
药品：阿莫西林、黄芪多糖、 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、
抑菌性能考察实验方案
纳米材料抑菌性能实验方案纳米银和纳米金的抑菌作用是其环境效应表现的一部分。
本研究将对生物合成的银和金纳米颗粒进行详细的抑菌能力性能测试。
本实验拟采用革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）和革兰氏阳性菌金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为模型菌进行抗菌实验。
实验采用通用的扩散法进行测定。
固体培养基组成（或LB培养基）：1L去离子水中加入蛋白胨5g，酵母提取物2g，氯化钠5g，牛肉膏1g，琼脂15g。
抑菌性能考察实验方案（1琼脂纸片扩散法，又称琼脂扩散法）取100µL细菌培养液（104cell/mL）平铺在固体培养基上，取新鲜合成的纳米颗粒50µL滴加在直径为5.5mm的圆形滤纸上，并放入固体培养基表面。
没有加入硝酸银进行纳米银合成的植物提取液作为空白样品同样进行抗菌实验。
样品最开始被放在4°C条件下进行扩散，然后在37°C条件下培养24h。
同时，采用广谱抗菌剂-庆大霉素或链霉素进行阳性实验对照。
根据抑菌圈的大小对抑菌效果进行评价。
图1 琼脂纸片扩散法抑菌性能考察实验方案（1琼脂井化扩散法，又称琼脂打孔扩散法）取1mL新鲜细菌培养液（细菌浓度为1×107 CFU）16-18h细菌培养液（刚过对数增长期）平铺在琼脂培养皿上。
自然干燥5min以后，使用无菌打孔器在琼脂板上开凿直径约5mm的孔，每个培养皿开凿4个孔，分别位于培养皿对称四个角上，如图所示。
然后用移液枪分别向各孔中滴加50µL不同浓度的提取液和生物合成纳米颗粒胶体溶液。
然后，将培养皿在37°C下培养24h。
在实验过程中，采用链霉素或庆大霉素作为阳性对照实验。
经过培养以后，细菌的生长抑制可以通过测定井化抑菌圈尺寸来进行考察。
实验需要平行三组样品。
图2 琼脂井化抑菌实验图3.6. Silver nanoparticle immobilization on cloth and disk diffusion studiesThe cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles did not show much difference in texture, wherea the cloth immobilized with PVDF containing silver nanoparticles turned slightly rigid. This change in texture is due to PVDF occupying the interface area of the fiber and forming a membrane-like structure upon drying. PVDF was selected based on its hydrophobic property, stability at wider range of temperatures and inertness to many chemicals. Fig. 5 shows the disk diffusion studies at various concentrations of silver nanoparticles. The cloth sprayed with sterile water and PVDF devoid of silver nanoparticles served as controls for respective plates. There was totally no inhibition by the cloth sprayed with only sterile water, whereas cloth sprayed with only PVDF showed mild inhibition of bacterial growth. From the Fig. 6, it was clear that increase in silver nanoparticle concentration increased the inhibition zone area on the plate, which directly represents the increase in toxicity. The cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles showed larger inhibition zone than cloth immobilized with PVDF. This may be attributed to the free availability of the silver nanoparticles in cloth immobilized with sterile water. In cloth immobilized with PVDF, a coat of the polymer might slightly inhibit the availability of the silver nanoparticles and thereby its toxicity. But the inhibition zone around the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles decreased vastly in consecutive cyclesafter washing compared to cloth immobilized with PVDF (Fig. 6). The purpose of using PVDF in the present study is to bind the silver nanoparticles to the cotton cloth, which will decrease the loss of the silver nanoparticles in consecutive washing. Thus as expected the loss of silver nanoparticles was lesser in cloth immobilized with PVDF compared to cloth immobilized with sterile water. In case of the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles,Fig. 5. Image of Petri plates showing the growth inhibition of E. coli by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) cloth immobilized with silver nanoparticles using PVDF.Fig. 6. Growth inhibition of E. coli in consecutive cycles by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) clothimmobilized with silver nanoparticles using PVDF.。
实验十二 抑菌实验
2.细菌接种 2.细菌接种
0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第 含菌量相当于麦氏比浊管第1 1/2的 每管加入 0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第1管1/2的 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 1.5
思考题
1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项 2.试述药敏试验的意义 试述药敏试验的意义。 2.试述药敏试验的意义。
操作程序 （以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 1.青霉素稀释 1.青霉素稀释
将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1 将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1～9的管号， 1ml肉汤的试管排成一列 的管号， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml 1ml， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml，混匀后吸取 1ml到第 到第2 混匀，再取1ml至第3 1ml至第 依次类推到第8 1ml到第2管，混匀，再取1ml至第3管，依次类推到第8管。 管不含青霉素的肉汤作对照管。 第9管不含青霉素的肉汤作对照管。
实表1 实表1 细菌对不同抗菌药物敏感度标准
药物名称 抑菌圈直径（mm）
无抑菌圈 ＜10 11～26 ＞26 无抑菌圈 ＜10 11～15 ＞15 无抑菌圈 ＜10 11～25 ＞25
敏感度
不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感
青霉素（50μg/ml）
链霉素（500μg/ml）
新霉素（300μg/ml）
（二）最低抑菌浓度试验
原理：将抗菌药物作倍比稀释， 原理：将抗菌药物作倍比稀释，在不同浓度的稀释 管内接种被检细菌，定量测定抗菌药物的最 管内接种被检细菌， 低浓度。 低浓度。本结论可作为其他药物敏感性试 验的标准方法。 验的标准方法。 实验材料： 实验材料： • • • • • 金黄色葡萄球菌肉汤培养物 普通肉汤 含青霉素64IU/ml 含青霉素64IU/ml 的普通肉汤各一管 麦氏比浊管 灭菌1ml 1ml刻度吸管 灭菌1ml刻度吸管
抑菌试验测定方法
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纸片法、牛津杯法等，但原理都是一样的，纸片法做起来比较简单，不用特殊的材料，可能比较适合你：
1.把实验室用的普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121度，20分钟）。
2.将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取1ml该菌悬液至灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，倒入适量（约4毫米厚吧）已灭菌的培养基（温度约45度，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
3.将用于试验的农药配制成几个所需的浓度，用无菌镊子夹起一片滤纸放入药液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基的中心，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴。
4.按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。
5.在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小，计算抑菌率就OK了！
希望能对你有帮助，有什么问题可以短消息我：）
2。
实验11-抗生素的抑菌试验
实验十一抗生素的抑菌试验一目的要求1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法2、了解抗生素的抗菌谱二实验原理抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。
抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。
由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。
而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。
新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。
微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。
三实验器材1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。
2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。
3、试剂青霉素、链霉素。
四方法步骤1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。
2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。
3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。
4、混菌平板制备取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。
5、平板加抗生素溶液将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡2min以上，然后将纸片放于混菌平板上，每皿呈三角形放3点，每点贴放纸片2张。
抑菌活性实验方案
八宝景天抑菌活性实验方案1 材料与仪器1.1 材料八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。
1.2 微生物真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。
番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。
1.3 试剂与仪器95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司马铃薯JFSD-100粉碎机上海淀久中药机械制造有限公司JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂RE-2000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂TDL-5A低速大容量离心机上海悦丰仪器仪表有限公司生化培养箱SPX-250型上海跃进医疗器械厂ZKF035电热真空干燥箱上海实验仪器厂有限公司KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司不锈钢手提式灭菌器上海申安医疗器械厂超净工作台上海生物科技有限公司1.4 培养基的制备真菌都用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖20g琼脂20g水1000mL pH值自然培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管或锥形瓶中。
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抑菌圈法实验流程
抑菌圈法（Kirby-Bauer法）是一种常用的抗菌药物敏感性试验方法，用于评估抗菌药物对细菌的抑菌效果和选择性。
实验流程如下：
1.材料准备
- 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）培养基：将霍乱弧菌分离菌落接种
到琼脂平板上，培养过夜。
-纯培养的霍乱弧菌菌液：选择一颗单菌落，将其转移到无菌培养基中，培养到对数生长期。
-抗菌药物纸材：将抗生素敏感纸片切成适当大小的圆片。
-灭菌钎子：用于将纸材固定在平板上。
-显微镊子：用于取出抗生素纸片。
2.制备琼脂培养基平板
-在无菌条件下，将琼脂培养基加热至溶解。
-将琼脂培养基均匀倒入培养皿中。
-放置琼脂培养基凝固。
3.制备菌液悬液
-用无菌生理盐水洗涤培养的霍乱弧菌菌落，使其悬浮在生理盐水中。
-用光度计测量悬浮液的浓度，调整到0.5的麦克斯韦尔稀释系数。
4.菌液接种
-用梅林巴赫管（或吸管）吸取菌液悬液，通过刮平盖玻片法将其涂抹在琼脂平板上。
-用无菌棉签将菌液均匀涂抹在琼脂平板上。
5.抗生素纸片覆盖
-用灭菌钎子将抗生素纸材固定在琼脂平板表面。
-用无菌镊子将预先标定好的抗生素纸片覆盖在菌液层上。
6.孵育
-将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中孵育24小时。
7.测量抑菌圈直径
-孵育后，观察平板上的抗生素纸片周围是否出现抑菌圈。
抑菌圈呈透明带状。
-用尺度卡测量抑菌圈的直径。
8.数据分析
-根据抑菌圈的直径，查阅相关参考表确定该抗生素对该菌株的敏感性。
注意事项：
-所有步骤都要在无菌条件下进行，以避免外部细菌的干扰。
-保持实验环境的洁净和安全，并进行相应的实验室安全措施。
-实验中要保持手部和工具的清洁，避免交叉污染。
-实验后应妥善处置实验废弃物，如纸材和实验用具。
抑菌圈法是一种简单、可靠的药敏试验方法，可用于评估抗生素的抑菌效果和终止治疗浓度建议。
通过该试验可以指导临床医生合理使用抗菌药物，防止药物滥用和耐药菌株的产生。
同时，该方法也可以用于研究新发现的抗生素的抗菌特性和敏感度。