酶切基础知识
分子生物学技术
分子生物学技术Technology of molecular biology课程编号：09061适用专业：动物医学(含本硕)学时数：32学时（理论12学时，实验20学时）总学分：2学分大纲主撰人：李强内容简介分子生物学技术作为一门兽医专业的选修课，是在分子生物学理论研究基础上，提出如何研究基因和蛋白质的方法。
不但具有重要的理论意义，而且更具有重要的应用价值。
该课程重点在核酸提取和纯化，PCR技术、DNA测序技术、DNA重组技术，基因组和蛋白质学技术；以及生物信息学技术等。
教学大纲一、课堂讲授部分（12学时）（一）各章节要点及授课时数第一章核酸提取技术2学时第二章 PCR技术：2学时第三章 DNA测序技术：2学时第四章 DNA重组技术：2学时第五章基因组和蛋白质组学技术：2学时第六章生物信息学技术：2学时（二）教材及主要参考书1教材：《实用分子生物学技术》赵晓瑜李继刚主编化学工业出版社2 主要参考书：《分子克隆实验指南》科学出版社《精编分子生物学实验指南》科学出版社二、实验部分1．实验简介分子生物实验技术是一门理论与实验技术相结合的重要专业基础课。
理论课讲授核酸提取、PCR、DNA测序技术、DNA重组技术，基因组和蛋白质学技术；以及生物信息学技术等。
实验采用现代实验的方法与手段验证理论的正确性，并用综合实验培养学生发散思维、跳跃思维向辩证思维的过渡。
实验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；PCR产物凝胶回收。
2．实验教学目标及基本要求本课程教学目标是培养学生动手能力、观察能力、分析问题和解决问题的能力，同时培养学生实事求是的作风和严谨的科研态度，为以后的科研工作打好坚实的基础。
通过对本门课程的学习使学生加深和巩固对分子生物实验技术基本知识和基本理论的学习和理解；学会运用分子生物学技术原理和方法来解决科研和生产中的问题；深入了解现代分子生物学的实验技术与仪器设备。
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
引物设计和载体构建知识点
引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。
本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。
一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。
一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。
1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。
2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。
同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。
引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。
4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。
过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。
通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。
二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。
载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。
1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。
根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。
2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。
通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。
3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。
连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。
4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。
总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。
3-1重组DNA技术的基本工具(教学课件)—— 高中生物人教版(2019)选择性必修3
当限制酶从识别序列
的中心轴线两侧将
5
3
EcoR I '
'
3
5
'ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
'
黏性末端
DNA两条单链分别 切开，带有几个伸出 的核苷酸，他们之间 正好互补配对，这样 的切口叫黏性末端。
限制酶(EcoRⅠ)能识别--GCTATAATATGC-- 序列，并在G 和A 之间切开
磷酸二酯 键,形成 黏性 末端。
6.识别序列长度
基因工程
重组DNA技术的基本工具
基因工程发展历程
History of genetic engineering
1944年艾弗里等人 通过肺炎链球菌的转 化实验，不仅证明了 遗传物质是DNA，还 证明了DNA可以在同 种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和
马太破译了第一个 1970年科学
编码氨基酸的密码 家在细菌中发
判断1：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端（√ ） 判断2：相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的（√）
02 D N A 连 接 酶 — “ 分 子 缝 合 针 ” DNA ligase —— "Molecular suture needle"
DNA连接酶—“分子缝合针”
1、作用：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的
1967年，科学家 发现，在细菌拟 核DNA之外的质 粒有自我复制能 力，并可以在细 菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限 制酶、DNA连接酶和逆转 录酶被相继发现。这些发 现为DNA的切割、连接以 及功能基因的获得创造了 条件。
1973年，科学家证 明了质粒可以作为基 因工程的载体，并实 现了物种间的基因交 流。至此，基因工程 正式问世。
转基因植物生物安全评价的基础与方法
转基因植物生物安全评价的基础与方法转基因植物已经成为了现代农业中的一个重要组成部分。
然而，由于其在种植、生理、遗传等方面与天然植物有所不同，因此需要进行生物安全评价。
本文将介绍转基因植物生物安全评价的基础与方法。
一、基础知识转基因植物，是指在原有的植物基因组中加入了来自其他物种的基因或人造基因。
由于转基因植物的基因组发生了改变，其存在着一定的风险，可能会对环境或者人类身体健康造成不利影响。
因此，对转基因植物进行生物安全评价是非常必要的。
二、评价方法（一）鉴别分析鉴别分析是生物安全评价的第一步，其目的是确定样品是否为转基因植物，以及含有哪些外源基因。
鉴别分析可以使用基因组测序、PCR扩增、酶切等技术手段。
其中，基因组测序是鉴别分析的最佳方法，能够快速准确地确定转基因植物的基因组组成和位置。
（二）生物学特征分析生物学特征分析，主要是通过对转基因植物的形态、生长、繁殖、生物量、生化成分等特征进行分析，评价其在生命表现上是否存在异于天然品种的特点。
其目的是寻找转基因植物是否具有较高的生长力、更强的抗病性，或者对其它植物和动物产生毒性反应等特征。
（三）毒理学评价毒理学评价是评估转基因植物是否存在毒性影响的关键步骤。
其主要方法是针对转基因植物的不同组织，使用各种不同原则的毒理实验，推算植物对人类与动物的毒素效应，评估转基因植物的安全性。
（四）营养学评价营养学评价是通过对转基因植物的营养成份进行分析，全面评价其对人体健康的影响。
该步骤通常包括成分分析、营养成分的生物活性和生物可利用度评估，以及滴定穴位分析等内容。
（五）生态学评价生态学评价主要针对转基因植物的生态环境影响进行评估。
常见的评价内容包括转基因植物在生态环境中的生长情况，是否对环境产生影响，以及对某一生态系统的生态影响等方面。
三、结论为了保证人类的生命安全和健康发展，对转基因植物进行生物安全评价是非常必要的。
转基因植物的生物安全评价需要对其进行鉴别分析、生物学特征分析、毒理学评价、营养学评价、生态学评价等步骤，以全面评估其生物安全。
卫生检验技术初级(师)考试大纲
卫生检验技术初级（师）考试大纲
基础知识
理化检验技术
细目 1.基本定律和元素周期律
2.溶液 3.化学反应速度和化学平衡 4.电解质溶液
5.缓冲溶液 6.胶体溶液 7.氧化还原反应 8.络合物和螯合物 9.碱金属和碱土金属 10.卤族元素 1.基本理论
要点 (1)摩尔 (2)阿伏伽德罗定律 (3)分配定律 (4)核外电子的运动状态 (5)原子核外电子的排布 (6)元素性质的周期性和原子结构的关系 (1)溶液的概念 (2)溶解度 (3)溶液浓度的配制 (4)溶液浓度的换算 (5)溶液的依数性 (1)化学反应速度 (2)影响化学反应速度的因素 (3)化学平衡 (1)电解质和电离 (2)电离度和强弱电解质 (3)弱电解质的电离平衡 (4)溶液的pH值 (5)酸碱指示剂 (6)盐类的水解 (1)基本概念 (2)缓冲溶液的作用和组成 (3)缓冲溶液的pH值 (4)缓冲容量 (5)缓冲溶液的配制 (1)基本概念 (2)溶胶的基本性质 (1)基本概念 (2)反应方程式配平 (3)氧化还原反应的应用 (1)络合物的基本概念 (2)络合物的结构 (3)络合物的性质 (4)螯合物的概念 (1)金属的通性 (2)碱金属和碱土金属的性质 (3)碱金属和碱土金属的化合物 (1)卤素的通性 (2)卤素单质及其化合物 (1)基本概念 (2)有机化合物的特性 (3)有机化合物的化学键 (4)有机化合物的分类
理化检验技术
单元
细目
要点
(1)计量法
1.计量法和法定计量单位
(2)计量法实施细则
一、计量法规和计量认证
(3)法定计量单位
(1)认证认可的依据
2. 计量认证/审查认可（验收）和实 验室能力认可
(2)认证认可的主要内容
高三生物知识遗传机制
高三生物知识遗传机制遗传机制是指生物体内遗传信息的传递和表达规律。
在高三生物学习中，遗传机制是一个重要的知识点。
本文将从以下几个方面详细介绍高三生物知识中的遗传机制。
一、遗传信息的传递遗传信息主要储存在生物体的DNA分子中。
DNA分子由两条互相缠绕的链组成，形成双螺旋结构。
每个DNA分子上含有许多基因，基因是DNA上具有遗传信息的特定序列。
遗传信息的传递过程主要包括复制、转录和翻译。
在复制过程中，DNA双链分离，每条链作为模板合成新的互补链，形成两个相同的DNA分子。
在转录过程中，DNA的一条链作为模板合成mRNA（信使RNA），mRNA携带遗传信息离开细胞核进入细胞质。
在翻译过程中，mRNA与核糖体结合，tRNA（转运RNA）将氨基酸带到核糖体上，根据mRNA上的密码子序列合成蛋白质。
二、遗传变异遗传变异是指生物体遗传信息在传递过程中产生的变化。
遗传变异是生物进化的基础。
遗传变异分为两类：基因突变和染色体变异。
1.基因突变：基因突变是指基因序列发生改变。
基因突变的原因有：自然辐射、化学物质、生物体内发生的错误等。
基因突变的特点是低频性、随机性、不定向性。
基因突变对生物体的影响有：有利、有害、中性。
2.染色体变异：染色体变异是指染色体结构和数目的改变。
染色体变异包括：染色体结构变异（如染色体片段缺失、重复、倒位、易位）、染色体数目变异（如个别染色体的增减、染色体组数目改变）。
三、遗传规律遗传规律是指生物体遗传信息在传递过程中的规律性。
遗传规律主要分为两大类：孟德尔遗传规律和染色体遗传规律。
1.孟德尔遗传规律：孟德尔遗传规律包括分离规律和自由组合规律。
分离规律是指在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因具有独立性，生物体在进行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代。
自由组合规律是指位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的，在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
基因工程诞生的三大技术基础
基因工程诞生的三大技术基础基因工程是一门利用生物学和工程学知识对生物体的基因进行修改和重组的学科。
基因工程的发展和应用得益于三项重要的技术基础，它们为我们实现对生物体基因的精确编辑和改造提供了关键的手段。
本文将重点介绍这三大技术基础，包括DNA测序、基因克隆和基因转化技术。
1. DNA测序DNA测序是基因工程的重要基础，它是对DNA分子中碱基序列的测定和分析过程。
通过DNA测序技术，我们可以了解一个生物体的基因组组成，确定基因的序列和结构，并进一步揭示基因功能和表达调控机制。
在过去几十年中，测序技术得到了突破性的发展，从传统的Sanger测序方法逐渐演变为高通量测序技术。
高通量测序技术能够同时测定大量DNA分子的序列，大大加快了基因组测序的速度和效率。
例如，第二代测序技术如Illumina和Roche 454平台，以及更近期的第三代测序技术如PacBio和ONT，提供了快速、准确且经济高效的测序方法，为基因工程研究和应用奠定了基础。
2. 基因克隆技术基因克隆是指将特定的DNA片段复制并在不同的载体中进行传递和扩增的技术。
通过基因克隆技术，我们能够获取特定的DNA序列，并将其大规模复制和扩增，为后续的研究和应用提供了充足的材料。
核酸酶切和DNA连接酶是基因克隆技术的重要工具。
核酸酶切可以切割DNA分子的特定序列，产生DNA片段；而DNA连接酶则能够将这些片段连接成为一个完整的DNA分子。
除此之外，还有重要的载体（如质粒）和宿主细胞（如大肠杆菌）用于存储和复制目标DNA。
通过将目标DNA片段与载体进行连接、转化宿主细胞并进行筛选，我们可以获得大量的目标DNA分子。
随着技术的进步，基因克隆技术也得到了不断改进和优化。
例如，重组DNA技术的发展使得我们能够将不同物种的基因进行组合，创造新的基因组合或表达系统，为基因工程研究和应用提供了更广阔的空间。
3. 基因转化技术基因转化技术是指将外源基因导入到生物体内并使其表达的技术。
PCR技术基础知识
反应体系-主要成分
TAQ DNA聚合酶： 一种热稳定的DNA聚合酶，耐高温，94℃保持1H，仍有50%以上活性
5’ → 3’聚合酶活性 5’ → 3’核酸外切酶活性 酶浓度高，易产生非特异性扩增；酶浓度低，导致扩增效率低，产 物量少
反应体系-主要成分
引物：人工合成的寡核苷酸序列，通常有两条 功能：作为核苷酸聚合过程的起始点，TaqDNA聚合酶可由其3’端 开始合成新的核酸链 探针：人工合成的一段寡核苷酸序列，与目的基因两条链中的其中 一条链的部分序列互补，qPCR中，探针序列两端标记有荧光染料 引物探针序列决定反应的特异性，浓度影响反应特异性，引物长度、 碱基组成决定反应的退火温度
半保留复制
DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开 •每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合 酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA双螺旋结构 •子代DNA双螺旋结构中的一条链来自亲代DNA，另一条链是：
•DNA保存于pH8.0的TE溶 液中
•变性：模板DNA或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后， 双链之间氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链 •退火（复性）：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55℃左右） 时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合 •延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料， 按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补 的链
核酸的化学组成与结构
•核苷酸的碱基有5种：A，G，C，T，U •DNA：由A，G，C，T构成，呈规则的双螺旋结构 •RNA：由A，G，C，U构成，呈单链结构
核苷酸的碱基互补配对原则
DNA双链的碱基之间通过氢键形成一一对应关系 •A==T(U)互补配对，G===C互补配对 •温度升高，可以使碱基之间的氢键断裂，DNA双链分离成单链 •温度降低，碱基之间可重新配对相连，形成DNA双链；
电泳生物知识点总结
电泳生物知识点总结第一部分：电泳基础知识1. 电泳原理电泳利用电场对带电生物分子的运动进行控制和分离。
在电泳过程中，通过一个外加电压，所施加的电场会使带电分子向电极移动，从而实现分离或纯化的目的。
2. 电泳仪器电泳仪器包括水平电泳仪、垂直电泳仪、毛细管电泳仪等不同类型，每种电泳仪器适用于不同的实验目的和生物分子的分离要求。
3. 电泳缓冲液电泳缓冲液是电泳过程中的重要组成部分，其PH值和离子浓度可以影响生物分子的迁移速度和分离效果，常见的电泳缓冲液包括TAE缓冲液、TBE缓冲液等。
4. 电泳分离介质电泳分离介质主要包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺膜等，不同的分离介质适用于不同类型的生物分子和分离要求。
第二部分：DNA电泳1. DNA电泳原理DNA电泳是利用DNA分子在电场中的迁移速度差异来分离不同大小的DNA片段。
DNA分子在电场中移动的速度与其大小成反比，较大的DNA片段迁移速度慢，较小的DNA片段迁移速度快。
2. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是最常用的DNA分离技术之一，通过将DNA样品混合物加入琼脂糖凝胶槽，施加电场进行分离，然后通过染料染色来观察DNA在凝胶中的分离结果。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于更大大小的DNA片段的分离，有更高的分辨率和分离效果。
4. 反转位点电泳反转位点电泳是一种用于分析DNA中的限制性内切酶酶切位点的技术，通过将DNA样品与限制性内切酶反应后进行电泳分离，可得出DNA片段的限制酶切图谱。
5. PFGE电泳PFGE电泳是一种用于分离极大DNA片段的技术，可用于分析细菌基因组、真菌基因组等极大DNA的分离和鉴定。
第三部分：蛋白质电泳1. SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是一种用于分离和鉴定蛋白质的电泳技术，通过SDS对蛋白质进行变性和去除二级结构，使得蛋白质呈现净电荷质量比接近的状态，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
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酶切基础知识酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。
通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。
酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。
对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。
但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
二. 凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。
目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、电源电压在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
第二节材料、设备及试剂一、材料λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; Hind Ⅲ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。
二、设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。
三、试剂1、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
3、溴化乙锭(EB溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。
第三节操作步骤一、DNA酶切反应1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
二、DNA分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。
λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。
HindIII切割DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。
EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度分别为21.2, 7.4,5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
三、琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。
将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。