酶学分析方法及酶活性测定复习与练习
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习一、有关酶的基本理论知识1、酶浓度与酶促反应速度的关系是？2、底物浓度与酶促反应速度的定量关系式是？3、影响酶促反应速度的因素主要有哪些？4、Km 及Vm 代表的含义及它们在临床酶活性测定中应用及意义。
二、酶活性测定的基本知识1、酶活性的概念及酶活性单位如何表示表示2、目前酶活性单位有---- 、 ------ 、-------- 三种表示方式。
？3、解释酶活性国际单位、催量（Katal）的概念，并比较两者的关系？4、酶活性单位的计算：几类计算公式要求理解并熟练应用。
1）通用公式2）惯用单位的计算公式（测定产物生成类的计算公式；测定底物消耗类的计算公式）3）** 连续监测法根据摩尔吸光系数进行酶活性浓度的计算；**连续监测法因素F值（全自动化生化仪多用K表示）的计算和应用？三、酶活性的测定方法1、酶活性测定的基本原则是什么？2、酶反应时间进程曲线有————、—————、————三个时期酶活性测定是在————期测定，此时期反应速度不受--------- 的影响也称---- 期3、根据反应时间，酶活性测定分为两类方法是----- 和---------- 两种从概念、结果计算、优缺点叙述并比较两类方法？其中连续监测法4、按检测对象的酶活性测定方法分为------- 和-------- 法；其直接法的方法类型有哪些？5、何谓酶偶联反应？写出酶偶联反应的基本模式？什么是待测酶、辅助酶、指示酶？6、何谓工具酶？酶作为工具应用于临床生化检验可进行酶活性测定或进行代谢物浓度（底物）的测定时一般有哪两大指示系统？何谓-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素有哪些？7、何谓同工酶？同工酶分析的常用原理有哪些？检测同工酶有何临床意义？并举例说明？8、酶活性测定条件及影响因素有哪些？9、从几个酶类测定（如AMY、ALT、LD、ALP|等）的实验操作中，讨论酶活性测定应注意的问题？10、试述影响血清酶的生理变异有哪些？11、酶活性测定，标本的采集、处理、贮存及样品试剂比有何要求？四、体液酶测定：1、常用于临床协助诊断的血浆酶有哪些？用于协助诊断心肌损伤、肝脏疾病、胰腺疾病、骨骼骨骼肌、前列腺疾病等的常用的血清酶有哪些？常用的临床诊断酶谱有哪些？2、将各血清酶活性测定的方法学原理进行分析归纳，请总结出有哪几大反应基础。
3、书写出AMS、ALP 两种（化学比色法、（连续监测法）方法及ALT、AST、GGT、LDH 、CK 酶测定（连续监测法）反应原理、主要试剂成分和作用？影响结果准确性因素有哪些？评价LD-L 反应和LD-P 反应试剂盒的优缺点？4、血清ALT、AST、ALP、GGT、AMS、CK、LD 等酶测定的临床意义？五、选择题：A 1、K m 是指反应速度为最大反应速度一半时的A 底物浓度B 酶浓度C 激活剂浓度D 温度E 抑制剂浓度D 2、根据1976 年国际生化学会生化委员会规定，酶的一个国际单位是指A 最适条件下，每小时催化生成1mmol/l 产物的酶量B 最适条件下，每分钟催化生成1mmol/l 产物的酶量C 最适条件下，每小时催化生成1umol/l 产物的酶量D 特定条件下，每分钟催化1umol 底物产生变化所需的酶量E 25C及其它最适条件下，每分钟催化lumol底物产生变化所需的酶量E 3、IFCC推荐法测定AST的辅助酶是A G6PDB HKC POD D LDHE MDHB 4、以NAD（P）或NAD（P）H为指示系统的酶活性测定主波长应设置为：A 293nmB 340nmC 405nmD 380nmE 500nmD5、以NAD还原为NADH反应为基础的生化分析，采用波长及吸光度变化为：A、340nm A下降B> 405nm A上升C、500nm A下降D、340nm A上升E、405nm A下降A 6、淀粉酶测定显著升高主要见于：A、溃疡病穿孔B、急性胰腺炎C、甲亢D、糖尿病E、肾病综合症C 7、正常成人血清LD 同工酶电泳区带的结果应符合：A LD1>LD2>LD3>LD4>LD5B LD1<LD2<LD3<LD4<LD5C LD2>LD1>LD3>LD4>LD5D LD3>LD1>LD2>LD4>LD5E LD4>LD1>LD2>LD3>LD5B 8、IFCC 推荐法测定ALP 选择用哪种缓冲液A 乙二胺B AMPC TrisD 甘氨酸E 二乙醇胺C 9、单底物酶促反应的最适底物浓度的确定原则：A 1KmB 2KmC 10~20KmD 100KmE 越大越好B 10、前列腺疾病最敏感的指标是：A ALPB ACP D CHE D AMY E ASTC 11自动化生化分析仪测定酶活性常用计算K 值的主要原因是A 方便B 准确C 无标准品和校正品D 酶校正品不准确D 12、GPT测定时，底物液中的a酮戊二酸的量比丙氨酸的量小近百倍的原因是A 防止酶促反应时，丙酮酸生成过量B 保证酶有足够的底物C防止基质中PH小于7.4 D 减少a酮戊二酸与2. 4二硝基苯肼的呈色反应E a 酮戊二酸过多可激活酶的活性D 13、AST测定（速率法）的试剂中，不含有A天冬氨酸B NADH C a —酮戊二酸D 丙氨酸E Tris 缓冲液C 14、酶联反应中最后一个外加酶称为：A 偶联酶B 辅酶C 指示酶D 工具酶E 同工酶D 15、ALP 测定（King 法）其底物是A 铁氰化钾B 酚C 4－AAPD 磷酸苯二钠E 丙氨酸B 16、血清ALT测定中，标准曲线为抛物线的干扰物为A丙酮酸B 2.4-二硝基苯肼 C 谷氨酸D a—酮戊二酸E 2.4-二硝基苯腙B 17> ALT测定（R —F）终止酶促反应是用A 0.4 mol/LN a OHB 2.4二硝基苯肼C a -酮戊二酸2.4二硝基苯腙D 磷酸盐缓冲液E 碳酸盐缓冲液A 18、血清ALT测定（R —F法），下列哪些情况会导致结果偏低:A 制作标准曲线所用的丙酮酸钠变质B 标本严重溶血C 对照管混浊未被发现D 水浴温度偏高（升至5 0C）E 血清与基质混合匀后未及时放入37C水浴保温A 19、100 n Kat单位酶量等于A6 IU D 2 7 8 IUB 2 7.8IU E 1 6 6 7 IUC 16 6.7IUE 20、根据米氏方程，不符合［S］与Km的关系的是A当［S］>> Km时，反应速度与底物浓度无关，成零级反应B当［S］vv Km时，反应速度与底物浓度成正比，成一级反应C 当［S］= Km 时，V = Vm / 2D 度量两者的单位是相同的E 当［S］= Km / 3 时，V = 67% VmA 丙氨酸+ a酮戊二酸—丙氨酸+谷氨酸B 谷氨酸C 肌酸+ATP —磷酸肌酸+ ADP DE 草酸乙酸+NADH —苹果酸+ NADB 21、AST催化的反应D 22、LDH催化的反应C 23、CK催化的反应A磷酸苯二钠B铁氰化钾C4-AAPD酚E碱性试剂B 24、ALP（K ing ）测定氧化剂C 25、显色剂D26、标准物A 27\底物A ALTB ALPC GGT DAMSA 28、肝细胞急性损伤最好的指标E CK-MB天冬氨酸+a 酮戊二酸—草酸乙酸+丙酮酸+NADH —乳酸+ NADC 29、肝占位性病变D 30 、急性胰腺炎E 40、心肌梗死B 41 、骨骼疾病A NAD （P）H 指示系统B POD 指示系统C 两者均有D 两者均无C 42、葡萄糖测定C 43、TG 测定B 44 、胆固醇测定B 45 、尿酸测定D 46、尿TP 测定（ALT AST 胆汁酸胆红素、肌酐等）A 平衡法C 两者均有A 47、GOD-POD 测葡萄糖B 48、碱性苦味酸法测肌酐C 49、GLDH 测尿素A 酶试剂法测定C 两者均有B 速率法D 两者均无B 离子选择电极法测定D 两者均无C 50、血清钠、钾测定C 51、血清氯、钙的测定A 52、血清磷的测定D 53 、血清总蛋白、清蛋白测定A 54、血清ALT 、AST 测定ABCD 55、酶偶联方法测定酶活性的有：A ALTB ASTC CKD AMYE LDHABCD 56 、下列哪些因素影响酶活性的测定A 缓冲液的种类和离子强度B PHC 反应温度D 激活剂浓度E 比色皿光径BC 57、酶促反应指示物的检测波长为405nm的有A NADHB 4-硝基酚C 5-氨基-2-硝基苯甲酸D 磷钼酸ABCD 58 ALT测定时，U A- B A的意义有A 消除2.4-二硝基苯肼溶液的A值B 消除a-酮戊二酸—2.4—二硝基苯腙的A值C 消除血清色素的干扰D 消除血可能存在的酮酸的干扰BC 59、属于Trinder 反应的色原物是:A H2O2B 酚C 4-AAPD PODE CODACDE 60.以下说法正确的是A .当[S]« Km时，反应速度与底物浓度成正比，成一级反应B. 当[S] >>Km时，反应速度与酶浓度成正比，酶促反应呈一级反应C. 零级反应时V=Vman=K[E]E NADPHD •一级反应是用工具酶测定各种代谢物浓度的方法学基础E. 零级反应是用于测定酶活性或浓度的方法学基础ABCD 61．溶血时对测定结果有影响的血清酶是A、CKB、LDC、ALTD、ASTE、GGTABE 62、ALP 活性升高可见于A、多发性骨肿瘤B、骨折C贫血D、甲低E、阻塞性黄疸AE 63、G6PD 可用于测定A、葡萄糖B、淀粉酶C、乳酸脱氢酶D、碱性磷酸酶E、肌酸激酶ACDE 64、下列代谢物与其酶法测定所用试剂的组合，正确的是A、尿酸一尿酸酶一过氧化氢酶B、葡萄糖一葡萄糖氧化酶一葡萄糖-6-磷酸脱氢酶C、尿素-尿素酶-谷氨酸脱氢酶D、三酰甘油一脂蛋白脂肪酶一甘油激酶E、胆固醇一胆固醇氧化酶一过氧化物酶ABDE 65、下列酶活性测定描述正确的是A、可测定产物的生成量B、可测定底物的消耗量C、与底物浓度无关D 、需最适温度E、需最适的酸碱度补充选择题：A 1当底物浓度大于Km时,此时的反应速度为A .零级反应B. 一级反应 C .二级反应 D .混合级反应E.无法确定反应级D 2、为保证酶动力学分析，底物浓度最好是：A．0.5Km B．2Km C．2~5Km D．10~20Km E．100Km3、连续监测法测定ALT 所用的底物通常是：对硝基苯酚磷酸钠C 4、测定下列哪种血清酶有助于鉴别ALP 的来源A．ACP B．AMS C．GGT D．LD E．CKB 5、疾病时血清及尿液淀粉酶升高，应除外：A •急性胰腺炎B •肝炎C.肠梗阻 D •急性腮腺炎 E •溃疡病穿孔其它练习：1以NAD+还原为NADH反应为基础的生化分析，采用波长是______________ nm,吸光度变化为_________________ .当测定时其S:R=1:20时（酶速率法）结果计算是IU/L= △ A/min x factor, factor 为_____________ （附NADH在340nm毫克分子吸光系数为6. 22）2、SGPT测定中底物成分要求DL丙氨酸的浓度为2 0 0 mmol/L a —酮戊二酸浓度为2 mmol/L，现欲配制5 0 0 ml底物，各应取多少m0（DL 丙氨酸M W=89, a —酮戊二酸M W=146）3、CK测定实验原理中酶联的催化顺序 ________ ________________________________ 。
酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
酶分析法
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些
原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸
收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成
为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
1、利用作底物的测定法
在一定pH及温度下测定反应初速度。反应时除被测物（底 物）外，其他影响反应速度的物质均为过剩，则反应初速 度与被测物的浓度成正比关系。
张晓静 2009.09
2、利用辅酶或抑制剂作用测定
如被测物质可作为某种酶专一的辅酶（或抑制剂），则这 种物质的浓度和将其作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速 度之间有关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进行这 种物质的定量。
二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。
缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力 二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
生物中图版选修1学案：第三章第一节酶的制备及活力测定含答案
第一节酶的制备及活力测定1．研究酶的存在和简单制作方法.2．尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。
一、酶的粗提取1．提取方法酶是在生物体活细胞中合成的。
多数酶在细胞内直接参与生物化学反应，少数的酶要分泌到细胞外发挥作用。
提取存在于细胞内的酶，需要破碎生物组织细胞,可用破碎仪、研磨器或匀浆器等机械将组织细胞破碎，使酶从活细胞中释放出来,进入细胞外的溶液中，经过滤、离心制备成粗酶液。
唾液淀粉酶、胰蛋白酶等分泌到细胞外的酶，可以直接从动物分泌物或细胞外的组织间隙中提取。
2．提取过程中影响酶活力的因素在酶的提取过程中，温度、酸碱性等多种环境条件都可能影响酶的空间结构,导致酶变性，直至丧失活力。
二、酶的活力1．酶的活力检测指标酶的活力通常以单位时间内底物的消耗量或者在单位时间内产物的生成量来表示。
例如，通过测定单位时间内麦芽糖的生成量来检测淀粉酶的活力。
由于麦芽糖与3,5－二硝基水杨酸试剂反应,能生成黄褐色产物，因此，利用分光光度法进行比色,可以测出麦芽糖的生成量。
另外，还可以通过测定单位时间内淀粉的消耗量来检测淀粉酶的活力。
2．分光光度法分光光度法是通过直接测定溶质对光的吸收能力来确定溶液浓度的方法。
在定量分析时，首先配制一系列浓度梯度的标准溶液，在分光光度计上,选取特定的波长，测出它们的吸光值。
以各种标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
比色测定待测样品时,操作条件应与绘制标准曲线时相同。
测出吸光值后，从标准曲线上读出它的浓度,以计算出待测物质的含量。
三、植物淀粉酶的制备及活力测定1．材料的选择萌发的水稻种子是提取淀粉酶的好材料。
2．操作过程（1)提取酶液。
（2）滴加酶液.（3）恒温处理。
（4)钝化处理.（5）测定吸光值。
(6）绘制标准曲线。
3．结果分析错误!＝错误!式中：A为淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（在标准曲线上查得，mg）；A′为淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg)；V为比色时所用样品液体积（mL）；t为酶促反应时间（min）。
功能酶学研究中酶活性测定方法的优化
功能酶学研究中酶活性测定方法的优化随着生物技术的不断发展, 酶在生产和生命科学研究中发挥着至关重要的作用。
酶的功能是由其催化活性决定的，因此测定酶的活性是酶学研究的基础。
酶活性测定方法的优化可以提高酶活性测定的精确度、准确度和稳定性。
本文将讨论常用的酶活性测定方法，以及它们的优缺点和如何进行优化。
一、对于不同类型的酶有不同的活性测定方法常见的酶活性测定方法包括光度法、比色法、荧光法、放射性同位素法等。
不同方法的选择取决于酶的类型和特性。
例如，对于氧化还原酶，可以使用比色方法，如NADH测定过氧化氢酶的活性。
在NADH的存在下，过氧化氢酶与过氧化氢反应，生成H2O和O2。
在反应过程中，NADH被氧化为NAD+并释放出H+，同时产生吸收波长为340nm的NAD+光学吸收。
另一个例子是，蛋白酶的活性测定可以使用比色法或荧光法，不同蛋白酶使用的底物也不同。
对于Serine 蛋白酶，可以使用小分子底物，如p-芒果酰-氨基苯甲酸-methylcoumarin amide (MCA)。
蛋白酶水解底物MCA时，会释放出荧光物质，其荧光值随蛋白酶活性的增加而增加。
二、优化光度法光度法是测定酶活性最常用的方法之一，其基本原理是通过光学测量反应物的浓度变化来测定酶的活性。
在吸光度法中，测量过程包括两个步骤：酶促反应的初速度测量和反应终点测量。
初速度测量包括对反应物质量、反应时间、反应体系中涉及到的物质浓度和反应温度等各项参数的优化。
在终点测量中，可以使用单一波长吸光度法或者连续多波长吸光度法。
单一波长吸光度法适用于只含有单一反应产物的酶促反应。
而多波长吸光度法适用于含有多个反应产物的酶促反应。
三、优化比色法比色法是通过与产生的产物的染色反应进行酶的活性测定。
对于某些酶来说，染色反应的产物是不稳定的，因此半衰期较短。
这样的反应不能用于连续测量，需要进行终点测量。
为了获得本底和最佳反应条件，实验过程需要对反应溶液的pH 值、温度、反应物比例等参数进行优化。
第八章-血清酶类测定
计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
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第三节 酶活性的测定
测定方法分类：
按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、 放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。 按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。 按照检测对象分类：分为直接法和间接法。
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三、酶促反应进程
吸 光 度 A
以产物生成量（或反 应物减少量）为纵坐标、 反应时间为横坐标作图所 得到的一条曲线，称为反 应进程曲线（或反应时间 曲线、速率曲线、时间曲 线）
延 滞 期
非 线 性 期 线 性 期
t1 图5-1
t2 酶促反应进程曲线
时间t
8
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定时法与两点法、终点法的区别
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t1
t2 时间t 图5-6 定时法的三种反应进程
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（二）连续监测法
原理： 连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性 期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法， 又称速率法、零级反应速率法、斜率法。 该方法是在一定的反应时间区段内（至少9～120s）每隔一定时间 （常为2～30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然 后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位 时间内的反应速率△A/min，最后据式计算出酶活性。
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（三）Vmax的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。 应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
酶工程第1章酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加
入的显色剂对－氨基苯磺酸和α －萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+ 或NADP + 在340nm处光吸收很少，而其还原
1000 0.3 15 μmol/min/mg protein 20
U/mg protein
二、酶活性测定的主要方法
温度、pH、离子强度（I=(1/2)Σ CZ 2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分
离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或
沉淀，就易于分离。
5 电化学方法
（electrochemistry）
① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋ 或减少H＋的反应来说，用1/1000 pH单位精度的pH 计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入 酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 ② 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物 和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微 电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变 化。 ③ 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流 变化。
1 katal＝6×107 IU
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习一、有关酶的基本理论知识1、酶浓度与酶促反应速度的关系是？2、底物浓度与酶促反应速度的定量关系式是？3、影响酶促反应速度的因素主要有哪些？4、Km及Vm代表的含义及它们在临床酶活性测定中应用及意义。
二、酶活性测定的基本知识1、酶活性的概念及酶活性单位如何表示表示2、目前酶活性单位有-------、----------、-------------三种表示方式。
？3、解释酶活性国际单位、催量（Katal）的概念，并比较两者的关系？4、酶活性单位的计算：几类计算公式要求理解并熟练应用。
1）通用公式2）惯用单位的计算公式（测定产物生成类的计算公式；测定底物消耗类的计算公式）3）**连续监测法根据摩尔吸光系数进行酶活性浓度的计算；**连续监测法因素F值（全自动化生化仪多用K表示）的计算和应用？三、酶活性的测定方法1、酶活性测定的基本原则是什么？2、酶反应时间进程曲线有————、—————、————三个时期酶活性测定是在————期测定，此时期反应速度不受------------的影响也称------期3、根据反应时间，酶活性测定分为两类方法是---------和--------------两种从概念、结果计算、优缺点叙述并比较两类方法？其中连续监测法4、按检测对象的酶活性测定方法分为----------和------------法；其直接法的方法类型有哪些？5、何谓酶偶联反应？写出酶偶联反应的基本模式？什么是待测酶、辅助酶、指示酶？6、何谓工具酶？酶作为工具应用于临床生化检验可进行酶活性测定或进行代谢物浓度（底物）的测定时一般有哪两大指示系统？何谓-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素有哪些？7、何谓同工酶？同工酶分析的常用原理有哪些？检测同工酶有何临床意义？并举例说明？8、酶活性测定条件及影响因素有哪些？9、从几个酶类测定（如AMY、ALT、LD、ALP|等）的实验操作中，讨论酶活性测定应注意的问题？10、试述影响血清酶的生理变异有哪些？11、酶活性测定，标本的采集、处理、贮存及样品试剂比有何要求？四、体液酶测定：1、常用于临床协助诊断的血浆酶有哪些？用于协助诊断心肌损伤、肝脏疾病、胰腺疾病、骨骼骨骼肌、前列腺疾病等的常用的血清酶有哪些？常用的临床诊断酶谱有哪些？2、将各血清酶活性测定的方法学原理进行分析归纳，请总结出有哪几大反应基础。
酶工程 酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加 入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原 形 式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处 光 吸 收 较 大 ， 因 此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和 NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。
1-氨基环丙烷-1-羧酸 （ACC）
第一章 酶活性单位 及其测定方法
一、酶活性单位 二、酶活性测定的主要方法
酶的活性
在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产 和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行 经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。
要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测 定方法。
酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查 酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化 某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
一、酶活性单位
酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与 酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的 大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个 酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制 剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状 态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的 酶活性单位来表示，即u/mg。
4 同位素测定法
（isotope determination）
用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产 物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或 沉淀，就易于分离。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。