酶学基本知识和技术
酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
酶学研究的新方法和技术
酶学研究的新方法和技术酶学研究是一门关于酶的性质、功能、结构和应用方面的学科。
酶是生物体内的一种催化剂，可以促进化学反应的进行，并且能够加速反应速率。
因此，酶学研究对于理解生物体内的代谢和各种生命活动具有重要的意义。
随着科学技术的不断发展，酶学研究也在不断地进行新方法和技术的探索。
一、蛋白质纳米粒蛋白质是一类大分子化合物，具有多种结构和功能。
近年来，蛋白质纳米粒成为了酶学研究的一个新兴领域。
蛋白质纳米粒的尺寸在1-100纳米之间，其结构可以被设计用于增强催化活性和稳定性，使得酶的催化效果更好。
同时，蛋白质纳米粒在生物医学和环境科学等领域具有很高的应用潜力。
二、电化学技术电化学技术是一种使用电化学反应探测酶反应的技术。
使用电极来测量酶催化反应所产生的电流，可以得到酶催化反应的速率和特异性。
这项技术具有灵敏度高、选择性好、样品不需要预处理等优点，因此得到了广泛的应用。
不过需要注意的是，电化学技术对于水溶性酶和需要金属离子激活的酶适用性较差。
三、DNA纳米技术DNA纳米技术是一种基于分子自组装的技术，可以用来制备具有特殊性质和功能的DNA纳米结构。
这项技术可以用于将酶催化活性的选择性和灵敏度增强到非常高的水平。
例如，可以使用DNA纳米技术来制备出特定结构的纳米酶，使得其在特定物质存在时能够进行高效率的催化作用。
此外，还可以使用DNA纳米技术来制备出具有药物释放能力的酶复合物，用于治疗多种疾病。
四、人工智能技术人工智能技术可以帮助酶学家从大量的数据中提取关键信息，使用信息来发现新酶并优化诊断和治疗疾病的方法。
例如，可以使用机器学习技术来发现新的酶反应路径，使得酶的应用领域更加广阔，而且可以使酶学研究变得更加高效。
总之，随着科学技术的不断发展，酶学研究的新方法和技术也在不断地涌现出来。
这些新技术不仅可以促进酶学研究的进展，而且还可以为酶在环境、农业和医学等领域中的应用奠定更加坚实的基础。
酶学知识与临床应用
酶学知识与临床应用酶学是生物化学领域中研究酶的一门学科，酶是生物体内一类特殊的蛋白质，具有生物催化作用。
在生物体内，酶参与了各种生化反应，调控了生物体的代谢过程。
酶学知识的深入研究不仅可以揭示生物体内复杂代谢网络的运作机制，还可以为临床医学提供重要的参考依据。
一、酶的分类根据催化反应的类型，酶可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、连接酶等多种类型。
其中氧化还原酶如氧化酶、还原酶等在细胞呼吸等代谢过程中扮演重要角色；转移酶如氨基转移酶、甲基转移酶等在氨基酸代谢、脂肪酸合成等过程中发挥作用；水解酶如脂解酶、葡萄糖醛酸乳糖酶等参与了碳水化合物、脂肪、核酸等物质的降解代谢。
二、酶在临床中的应用1. 临床诊断：酶学知识在临床诊断中有广泛应用。
比如肝脏疾病中的肝酶检测，心肌梗死中的肌酸磷酸激酶检测等，都是利用不同酶的活性变化来帮助医生确定疾病诊断。
2. 药物开发：药物研发过程中，酶学知识也起着举足轻重的作用。
很多药物都是通过调控特定酶的活性来达到治疗作用。
比如抗病毒药物通过抑制病毒酶的活性来抑制病毒复制。
3. 生物技术：酶在生物技术领域也有重要应用，如聚合酶链反应（PCR）是利用DNA聚合酶来扩增DNA序列的技术，已经成为分子生物学中不可或缺的工具。
三、酶学知识在临床中的挑战与展望随着酶学知识的不断深入研究，也不可避免地面临着一些挑战。
比如在药物研发中，酶抗性、酶变异等问题常常会成为难题。
而在临床诊断中，不同疾病状态下酶活性的变化也可能会影响诊断结果的准确性。
然而，随着科技的不断发展，人们对酶学知识的理解也将更加深化，未来有望通过基因编辑、蛋白工程等技术手段，进一步拓展酶学在临床中的应用领域，为医学诊疗带来更多的机遇与可能。
总之，酶学知识作为生物化学中的重要分支，对于生命科学和医学领域都具有重要的意义。
通过深入研究酶的结构、功能、调控机制等方面，可以更好地揭示生物体内代谢过程的奥秘，为临床医学的发展提供更多的启示和帮助。
食品酶学
食品酶学一、名词解释1、酶：酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。
2、胞外酶（exoenzyme）：酶在活细胞中产生，被分泌到细胞外发挥作用。
如人和动物消化管中以及某些细菌所分泌的水解淀粉，脂肪和蛋白质的酶3、胞内酶：酶在活细胞中产生，在细胞内起催化作用，这些酶在细胞内常与颗粒体结合，并有着一定的分布4、多酶体系（multienzyme system）：体内物质代谢的各条途径往往有许多酶共同参与，依次完成反应过程，这些酶不同于多酶复合体，在结构上无彼此关联。
故称为多酶体系。
5、同功酶（(isoenzyme）：指在生物体内或组织中催化相同反应而具有不同分子形式（包括不同的AA序列、空间结构等）的酶。
6、酶活力单位（active unit）：在一定条件下,一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。
7、酶原：不具有活性的酶的前体。
8、酶比活力（specific activity）：单位蛋白质（毫克蛋白质或毫克蛋白氮）所含有的酶活力（单位/毫克蛋白）9、酶的化学修饰（chemical modification）：通过化学方法使酶分子的结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
10、固定化酶（immobilized enzyme）：指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶11、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：以特定的基因片段为模板，利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核苷酸为底物，在DNA聚合酶的作用下，通过DNA模板的变性，达到基因扩增的目的二、选择或判断（10题）三、简答题1、酶的特性及其对食品科学的重要性⑴酶的一般特性：酶的催化效率高（比一般反应速度快106-1013倍）、酶作用的专一性（键专业性、基团专一性、绝对专一性、立体异构专一性）、大多数酶的化学本质是蛋白质⑵酶对食品科学的重要性：①酶对食品加工和保藏的重要性：；例如葡萄糖氧化酶作为除氧剂普遍应用于食品保鲜及包装中，延长食品保质期。
(完整word版)酶工程
名词解释1。
酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
2。
自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物?？3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶4。
诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5。
Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6。
离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1．酶的转换数:酶的转换数Kp.又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数.2．酶的催化周期:酶进行一次催化所用的时间。
3．固定化酶的比活力：指每克干固定化酶所具有的6活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。
4．抗体酶：又称催化行抗体。
是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白,要使机体具有生物催化功能，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，以及酶的高效催化能力。
是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是自然界原本不存在的。
5．端粒酶：是一种核酸核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分.其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列,在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上,使端粒延长。
6．核酶:核酸类酶。
为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。
它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应。
7．KS分段盐析：指在一定温度和PH值条件下，通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法.8．B分段盐析：指在盐和离子强度条件下，通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法.9．凝胶层析：又称凝胶过滤,分子排阻层析，分子筛层析等。
生物技术概论_酶工程
理法、结合法、交联法和热处理法等。
适合细胞
1、 吸附法 多孔性固体吸附剂有吸附能力（为什么）？
常用物理吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻 土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶等。 特点：操作简便，条件温和，但结合力较 弱，使用受到限制。
2、结合法
指通过选择适宜的载体，使之与酶以共价键或 离子键的形式结合在一起而被固定化的方法。 根据成键的不同，分为离子结合法和共价结合 法。 特点：结合很牢固，酶不会脱落，较长时间使 用，但操作复杂，可能对酶活有影响。
如何使辅助因子不脱落？
（3） 产物的除去
如何解除酶反应中常存在的产物抑制作用？
（4） 相扩散的促进 如何提高酶对水不溶性底物作用机会和固定化 酶反应中的物质传递？ （5） 多酶反应的实现 如何满足不同酶的不同条件要求？
二、常见酶反应器的特点与类型
1、 酶反应器的类型概述
按几何形状和结构来分，可分为罐型、管型、膜 或片型几种。
（一）细胞破碎 1、机械破碎法
机械捣碎法：旋转剪切力
研磨法：研磨剪切力（常加助磨剂）
匀浆法：相对运动剪切力
2、物理破碎法
（1） 温度差破碎法：
适合于处理脆壁细胞如G—的破碎。 适合于膜结合酶的细胞。
其能量质点作用于膜上某点而产生空穴。效果 与多因素有关。
（2） 压力差破碎法：
（3） 超声波破碎法：
（三） 酶的保存
保护要有利于维护酶的天然构象的稳定。 （尤其时在使用过程中） 保存要注意： 温度 缓冲液 酶浓度及纯度
第三节 酶分子的改造
一、酶分子修饰
二、酶的蛋白质工程
三、生物酶的人工模拟
酶学分析技术(1)
1
酶活性的单位是指在特定的条 件下，使酶促反应达己规定在某特定
条件下生成一定量的产物为一个单位。 2.国际单位（IU）
在规定的实验条件下，每分钟催 化1µmol底物发生反应的酶量。 3.Katal
酶偶联测定法
EX
Ea
Ei
A
B
C
P
LDH、MDH、G6PD、GLDH作工具酶均是 以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。
P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P)+
17
将水溶性的酶，通过物理或化学的 方法，使其吸附、包埋或共价结合在 固相载体上，成为不溶于水但仍保留 催化活性的酶的衍生物称为固相酶。 优点：可反复使用
机械强度大 稳定性好 抗干扰性强
18
几种酶的稳定性（天）
名称
室温 4 ℃ -20℃
乳酸脱氢酶
7 7 30
天冬氨酸氨基转移酶 2 14 30
丙氨酸氨基转移酶 2 14 30
肌酸激酶
0.3 0.6 2
碱性磷酸酶
0.5 6 600
淀粉酶
2 60 60
19
同工酶的产生机理
❖ 不同基因位点编码 ❖ 等位基因编码 ❖ 多条肽链化学修饰产生
13
2.连续监测法（又称速率法）
每隔一定时间（10～60秒）连续测定酶 促反应中某一产物或底物变化量称为连续监 测法。 优点 容易找到线性期、结果可靠、省时、 省试剂、省样品 缺点 反应速度易受温度、pH、底物浓度 等因素的影响。
14
工具酶
酶学分析是将酶作为试剂的一种分 析技术，它包括：
酶工程复习资料
由活细胞产生的生物催化剂，具有特殊作用的蛋白质，能在生命体内(包括动物、植物和微生物)催化一切化学反应，维持生命特征。
是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学， 以应用目的为出发点来研究酶， 利用酶的催化特性并通过工程化将相应原料转化为目的物质的技术。
水溶性酶经物理或者化学方法处理后成为不溶于水的但仍 具有酶活性的一种酶的衍生物，在催化反应中以固相状态作用于底物。
表示酶活力大小的尺度；一个国际单位(IU)是指在特定条件下(25℃)，每分钟内转化 1mol 底物或者催化形成 1mol 产物所需的酶量。
一个 Kat(卡塔尔，酶活性国 际单位)是指每秒钟内转化 1mol 底物所需的酶量， 1 Kat = 6107 IU 。
(酶活力：指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下， 所催化的反应初速度来表示； 是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。
) 是酶纯度的量度，是指单位分量酶蛋白所具有的酶活力，单位为 IU/mg 。
比活力越大，酶纯度越高。
比活力=活力单位数/每毫克酶蛋白。
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) (一种变构蛋白)，通过与效应物(effector) (包括诱导物和辅阻遏物)的特异结合而发生变构作用，从而改变它与控制基因的结合力。
调节基因常位于调控区的上游。
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，控制酶合成的时机与速度。
决定某一多肽的 DNA 模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA ，再翻译为蛋白质。
是指在一定的条件下，用适当的溶剂或者溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到 溶剂或者溶液中的过程。
是指在份子水平上不同粒径份子的混合物在通过半透膜时，实现选择分离的技术，半透膜又称为分离膜，膜壁弥漫小孔，根据孔径大小可以分为：微滤膜( )、超滤膜(uF)、纳滤膜(NF)、反渗透膜(RO)等，分离都采用错流过滤方式。
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酶学基本知识和技术第四章酶学基本知识和技术酶是活细胞产生的，并能在体内外起催化作用的一类特殊蛋白质。
酶定量测定越来越多的应用与临床，而且在诊断、鉴别诊断上起着重要作用。
第一节酶活性测定的基本知识在临床生化检验中，测定酶活力的方法，通常有两种：1.在一定条件下，单位时间内，被酶作用的底物减少量或产物生成量。
2.在一定条件下，酶活力与反应所需时间成反比的关系。
一、酶活性的概念和单位（一）酶活性的概念在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶的活性。
如果将酶反应中S或P对t作图，可得到酶反应时间进程曲线图。
在线性期S和P的变化量与时间呈线性关系：V===K一般情况下，产物的减少量和产物的增加量是一致的，但测定产物的生成比测定底物的减少好。
因为反应体系中底物往往过剩，而产物是从无到有的，只要方法灵敏，测定的准确度可以很高。
所以，酶活性测定大多采用产物生成法。
（二）酶活性单位是指在某特定条件下，使酶反应达到某一速度所需的酶量。
有三种表示方法：1.惯用单位：大多是由方法的作者自己规定，在某一特定的条件下，生成一定量产物为一个单位。
所以不同的酶，甚至同一个酶，不同的测定可有不同的定义。
如ALT测定，改良穆氏法、金氏法、赖氏法的单位定义各不一样。
所以无可比性。
2.国际单位：1964年国际生化协会所规定的国际单位（IU）：即规定实验条件下，每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。
如表示血清中酶浓度多以U/L表示之，即IL标本（血清）中含的酶量。
我国医学界对此表示方法已经熟悉习惯。
缺点：①惯用单位换算国际单位麻烦。
②有些大分子量底物不明。
③同一种酶用不同的测定国际单位仍不相同。
3. Katal单位：Katal，指在最适条件下，每秒能催化1摩尔底物发生变化的酶量为1个Katal 单位。
1U＝16.67μKatal（或1/60μKatal）。
二、酶活性的测定酶活性测定中，一定要保证过量的底物，以保证反应是在线性期进行，酶活性测定分两种类型：1.终点法：(end-point analysis)固定时间法：先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加入试剂进行化学反应呈色测出底物和产物的变化。
由于比色法灵敏度较低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分钟左右。
历史上这类方法常被命名为“终点法”、“二点法”、“固定时间法”和“取样法”。
大多数文献使用“固定时间法”。
此命名指出了用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。
最基本一点的是此类方法停止反应后才测底物或物的变化。
优点：简便、比色时无需考虑保温，显色剂的选择，也不必考虑对酶的影响。
缺点：无法了解酶作用的这一段时间是否在线性期。
“固定时间法”测定时间长达30分钟，很难满足上述方法学上测定初速度V0的要求。
图17-8 二点测定法中可能引起的误差从图上看：1的反应速度已逐渐减小，2的反应速度逐渐开始增大，3的反应速度达线性期。
所以，采用终点法时，首先要测定酶反应的曲线，避开延滞期和非线性期。
以及其他条件的影响。
★2.连续检测法：（continuous monitoring assay）(动力学法、速率法、连续反应法)每隔一段时间（10～60秒）连续测定酶反应中某一产物或底物的变化量称为速率法。
定时法只测两个时间点，而速率法则进行多点连续测定，将这些点连成线，很容易找到线性期，在此段中计算酶活性，结果当然可靠准确。
而且不需终止反应，是边反应边测定。
但速率法要求检测仪器有恒温装置，且底物和产物可直接测定。
优点：省时、省试剂、省样品，对干扰不明显。
可以不作空白，适用于自动分析。
缺点：反应速度受多种因素的影响。
所以在反应中需严格控制反应条件（温度、PH底物浓度等）（二）酶活性单位的计算：此中ε为摩尔（线性）吸光体系（mol－1·L·cm－1）△A为吸光度变化v 为标本体积（ml）V为反应体系体积（ml）L为光径（cm）在实际测定中后面几项皆为常数，所以上式常简化为：三、影响酶活性测定的因素（一）样品：1.是否溶血？红细胞中某些酶活性比血浆高，如LDH红细胞中的活性比血浆中高150倍，ALT和AST红细胞比血浆高15倍和17倍。
所以溶血后对这些测定有影响。
但单氨氧化酶、CK红细胞缺乏，所以即使严重溶血，上述两酶不升高。
2.抗凝剂：某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA可抑制需钙离子的淀粉酶和需要镁离子的肌酸激酶等。
所以，生化检验一般用血清标本，需用血浆时，也用肝素抗凝。
3.样品存放时间：各种酶的稳定性不一样如前列腺测定的酸性磷酸酶，在室温下也迅速失活，尤其在碱性溶液中失活更快，37℃也失活，所以高热患者不能正确测定此酶活性。
故对酶测定要注意其稳定性。
（二）测定条件1.温度：酶的最适温度一般在35℃～40℃之间。
2.PH：主要是改变底物的解离状态，影响底物与酶的结合。
改变酶活性中心基团的解离状态，影响酶活性。
3.缓冲液性质：选择缓冲液应注意①缓冲液中弱酸的pK应与要求的pH值相近；②缓冲液对酶活性无抑制；③在紫外可见光区没有或仅有少量光吸收现象。
4.底物浓度：要使反应速度v接近最大反应速度Vmax，一般设计［S］为10－20Km为宜，因为此时v达到Vmax的90％－95％。
5.酶浓度：［S］<<［E］，酶才能被［S］饱和，反应速度达最大值，所以当［S］过高时，应将标本适当稀释再加以测定。
6.激活剂：7.抑制剂：五、酶促反应底物动力学酶促反应速度与底物浓度不成直线，而成双曲线关系，如图：底物浓度当底物浓度很低时，酶反应速度几乎随底物增加成正比例加快，进一步升高底物浓度，虽然反应速度也加快，但增加速度愈来愈慢，不成比例。
到一定程度，反应速度趋于恒定为一常数，实际上就是趋向最大反应速度V，测定此处的反应速度V，最能准确地反映酶量多少。
在此处底物浓度变化，对反应速度影响很小。
Michaclis和Menten二式首先在本世纪初对酶反应的此项独特现象从理论上加以合理解释。
并推导出著名的米-门方程式：此公式对选择酶测定的底物浓度有重要的指导作用。
Km对每一种酶而言在一定条件下为一常数，并可从上述方程式求出，在反应速度为最大反应速度V 一半时，代入上式得：Vkm＋V[S]＝2V[S]VKm＝V[S][S]＝Km换言之，当酶促反应速度为最大反应速度一半时，此时的底物就相当于酶的米氏常数Km。
以mol/L表示之，大多数酶Km在10-3至10-5mol/L之间。
表7-1 底物浓度与Km比值相当的最大反应百分比[S]/Km V/Ｖ×100100.099.010.091.01.050.00.19.00.010.99依据上表一般都认为酶测定时底物浓度最好为Km的20倍乃至100倍。
在实际工作考虑到底物溶解度的限制，价格的昂贵，可将底物浓度降为Km的10倍。
再低就不适合酶的测定，可能产生较大误差。
以上规律适用于大多数酶。
一些酶还有其特殊情况，常能遇到的是当底物浓度增加到一定范围后，酶反应速度不仅不增加，反而下降。
如乳酸脱氢酶，当丙酮酸浓度超过一定量时，酶活性反而下降，故丙酮酸浓度不能过高。
（一）米氏常数的意义1.鉴定酶的种类：km值是酶的特征性常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和性质有关，与酶浓度无关。
不同种类的酶km值不同，对于未知的酶，可在规定条件下测定其km值加以鉴定。
2.反映酶和底物的亲和力：km值越大，酶与底物亲和力越小，反之亦然。
因为km值越大，表示只有在底物浓度很高时，酶才能与底物定量结合，反应速度才能达到1/2最大速度。
3.选择酶的合适底物km值取决于酶的种类和底物的性质。
酶一定时，不同的底物由不同的km 值。
一般考虑酶的最适底物。
4.设计时宜的底物浓度底物浓度一般设计在10－20km,这样可使酶的最大速度达到90－99％。
二、工具酶（一）概念许多酶反应中，底物或产物的变化量很难直接测定，常需要在反应体系中加入一些能与产物作用但又不干扰酶反应的试剂，使第一个酶反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的产物。
通过这种偶连反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶活性。
概念：这种作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶就叫做工具酶。
常用的工具酶是氧化还原酶，其次还有水解酶、转移酶等。
一个酶反应的产物如不能或不易直接测定，可另加一个酶把其转变成一个能够或容易测定的产物，然后再进行测定；有时两个还不够，还需再加第三个酶才能测定，这种测定方法叫酶偶联测定法。
A B C PA底物；B、C中间产物；P产物；Ex测定酶；Ea辅助酶；Ei工具酶例如：葡萄糖＋O2 葡萄糖酸＋H2O2H2O2＋4－AAT＋酚醌类化合物GOD是测定酶；POD是工具酶。
工具酶的要求：有工具酶参与的反应中，工具酶的用量一般较多，所以工具酶必需来源广泛，价廉易得，纯度要求不是很高。
但对工具酶得杂质要有限制，这样才能保证工具酶的活性。
（一）常用工具酶及其指示反应1.脱氢酶：用作脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，最常用的是LDH （乳酸脱氢酶），MDH（苹果酸脱氢酶）; GLDH（谷氨酸脱氢酶）；G6PDH（6－磷酸葡萄糖脱氢酶）。
这些酶有一个共同的特点，都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶。
NAD(P)H在340nm处有一最大吸收峰，可以通过测定340nm处光吸收的增加量和减少量来表示酶的活性。
本法的缺点：需要紫外分光光度计；需高纯度的酶和辅酶；灵敏度较低。
2.过氧化物酶：POD可以催化H2O2与某些色原反应，例如与4－氨基安替比林(4_ATT)和酚起反应，将其氧化为有色物质。
（Trinder氏反应）。
Trinder氏反应易受维生素C、胆红素、尿酸还原影响（因为这些物质也可还原过氧化氢，而使结果降低）。
GOD（葡萄糖氧化酶）；甘油氧化酶；胆固醇氧化酶（COD）；尿酸酶等都可将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以和POD偶联，通过Trinder氏反应加以测定。
第三节同工酶的测定同工酶是指催化功能相同，但分子组成和理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或在杂交体。
同工酶在体内往往显现组织器官的区域化分布或细胞内区域化分布，具有组织特异性，因而同工酶的测定具有很大的临床诊断价值。
目前不论在诊断肿瘤，还是诊断心脏、肝等疾病上都找到一些较总酶活性测定特异性、灵敏度高的同工酶测定项目，同工酶正逐步成为酶学中一个重要分支。
80年代发现某些同工酶从组织进入体液后，进一步变化分为数个不同类型即所谓同工酶的亚型（isoform）。
CK-MB的亚型MB1、MB2，CK-MM亚型MM1、MM2和MM3在AMI的诊断和溶栓疗效判断上都优于总酶和同工酶。