DNA测序常见问题解析
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
基因测序数据处理与分析方法分析
基因测序数据处理与分析方法分析基因测序是指以高通量测序技术为基础，对DNA序列进行大规模分析的过程，用于对基因组、转录组或单个基因进行研究。
基因测序数据的处理和分析是基因测序研究的重要一环。
本文将介绍一些常见的基因测序数据处理和分析方法。
一、原始数据处理基因测序技术产生的原始测序数据包括FASTQ格式的序列文件，需要进行以下处理：1. 质量控制测序数据中包含了由于测序误差产生的错误碱基，这些错误碱基会对后续的分析产生影响。
因此，需要对测序数据进行质量控制。
通常采用的方法是使用软件工具进行去除低质量序列（如Trimmomatic）。
2. 序列比对将原始测序数据比对到一个基因组参考序列上，以确定每个序列片段来源于不同的基因或区域。
常用的软件包括Bowtie2和BWA。
二、基因组重测序与比较基因组学基因组重测序是指对已有的基因组进行测序并进行序列比对，以确定基因组的完整性和准确性。
比较基因组学是指通过对多个物种的基因组进行比较，来研究它们的演化关系。
这些研究都需要对基因组序列进行以下处理和分析：1. 基因组装连续的序列数据中包含了来自同一个基因的多个片段，需要将这些片段进行拼接以形成完整的基因。
常用的软件包括SPAdes和SOAPdenovo。
2. 基因注释基因注释是指对基因组序列进行功能注释，以确定基因的具体功能。
注释方法包括比对到已知基因库、预测开放阅读框、功能域预测等。
3. 基因演化分析基因演化分析是指通过对不同基因、物种的基因组序列进行比较，研究它们的演化关系。
常用的软件包括PhyML和MrBayes。
三、转录组测序与差异表达分析转录组测序是指对细胞中所有mRNA的测序，以研究某些生物过程中变化的基因表达。
差异表达分析是指比较不同条件下的基因表达量，从而确定哪些基因在这些条件下发生了显著的变化。
处理和分析转录组测序数据包括以下步骤：1. 转录组装与基因组装类似，需要对连续的序列数据进行拼接以形成完整的转录本。
细菌16SrDNA注意事项以及常见问题解析
细菌16SrDNA注意事项以及常见问题解析细菌 16S rDNA 鉴定主要分为 7 个部分：1.提取细菌基因组 DNA,2.设计/选择引物进⾏ PCR 扩增，电泳检测纯度与⼤⼩。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收⽬的⽚段5.⽬的⽚段测序。
6.BLAST ⽐对获取相似⽚段7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌⽣长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响 DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前⽤ TE 缓冲液对菌体进⾏洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），⾼温⾼盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调 pH，每升⾼ 1，pH⼤约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，⽤ NaOH 调 pH ⾄ 8.0（约 20g）,⾼温⾼压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取 20ml。
⾼温⾼压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer ⽤ 10×TE Buffer 稀释 10 倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称 10g，68加热溶解，⽤浓盐酸调 pH ⾄ 7.2。
室温保存。
⽤之前在 65溶解。
配置时要戴⼝罩。
6、5M NaCl：称 292.2gNaCl，⾼温⾼压灭菌，4保存。
、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解 4.1g NaCl，加 10g CTAB（⼗六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
⽤之前在 65溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的⽐例加⼊异戊醇。
DNA测序技术原理：基因组中的碱基序列分析
DNA测序技术原理：基因组中的碱基序列分析DNA测序是分析基因组中的碱基序列的技术，它的原理基于化学、生物学和计算机科学的多学科知识。
以下是DNA测序技术的基本原理：1. 样本准备：DNA测序的第一步是准备DNA样本。
样本可以来自生物体的细胞，可以是整个基因组的DNA，也可以是特定基因的DNA。
2. DNA复制：DNA样本中的DNA链被复制，以产生更多的DNA。
这通常通过PCR （聚合酶链式反应）或其他放大技术来完成。
3. DNA片段化：复制的DNA链被切割成短片段，通常长度在几百到几千碱基对之间。
4. 测序反应：使用测序反应来确定每个DNA片段的碱基序列。
目前有多种不同的测序技术，包括Sanger测序、Next-Generation Sequencing（NGS）等。
5. Sanger测序原理：反应体系： Sanger测序使用一种特殊的DNA聚合酶、DNA引物、四种不同的荧光标记的二进制核苷酸和可终止DNA链合成的二进制核苷酸（dideoxynucleotide）。
合成终止：在DNA合成的过程中，如果在新合成链上加入了带有荧光标记的dideoxynucleotide，DNA链的生长就会终止。
分离与检测：反应产物通过凝胶电泳分离，然后使用荧光检测器检测荧光标记的终止核苷酸，从而确定DNA链的碱基序列。
6. Next-Generation Sequencing（NGS）原理：并行测序： NGS技术允许同时测序许多DNA片段，通过并行处理大量的DNA序列信息。
荧光标记： DNA片段被标记，然后通过光学或电化学方法进行测量。
数据分析：通过计算机进行大规模的数据分析，将碱基序列的信息还原出来。
7. 数据分析与装配：通过计算机对得到的测序数据进行分析，将碱基序列还原成原始DNA序列。
这包括去除杂音、纠正测序错误和对碱基进行准确的排序。
8. 结果解读：最后，通过生物信息学工具和数据库比对，对DNA序列进行解读，找到基因、调查变异或识别其他生物学信息。
基因测序技术的优缺点分析
基因测序技术的优缺点分析随着科技的不断进步和发展，基因测序技术越来越成为人们关注和利用的焦点，被广泛应用于医学、农业以及科学研究等方面。
这项技术可以帮助我们深入了解基因信息和变异情况，提高研究和治疗的准确性和效率。
然而，基因测序技术也存在一些缺点需要我们及时解决和改进，本文将对其优缺点进行分析。
一、基因测序技术的优点1.精确性高基因测序技术可以高度精确地分析和鉴定某个体的DNA序列，对于发现基因突变等有很高的准确性和可靠性，尤其对于在早期就可以有效识别和预防患者疾病产生的风险，有着不可替代的意义。
2.广泛的应用领域基因测序技术的应用范围非常广泛，无论是在医学、科学研究还是在农业、食品安全等领域都有巨大的作用和潜力。
医学领域可以用于疾病诊断、药物研究和发展；农业领域可以用于改良作物、提高品质和种子的选育；食品安全领域可用于检测食品中是否含有致病菌、过敏原等。
3.研究成本低随着技术的逐渐成熟和普及，人们对基因测序技术的需求也呈现出爆发式增长。
而与此同时，技术成本也逐渐下降，人们可以用更少的资金完成基因测序，从而进一步推动技术的发展和应用。
二、基因测序技术的缺点1. 数据管理和隐私问题基因测序技术产生了大量数据，数据的存储和管理成为了一个巨大的挑战。
同时，与此相关的隐私问题也愈加突出，人们对于个人基因信息的保护和使用引起了很多争议，需要制定更加严格的规定和方案。
2. 准备样本问题在进行基因测序之前需要提供足够的DNA样本，常见的样品类型有血液、唾液、皮肤等。
准备样本需要高度专业的知识和技术，有时还需要侵入性操作，具有一定风险和限制。
3.分析难度由于基因测序产生的数据非常庞大而复杂，在数据分析阶段可能会遇到巨大的困难。
数据分析需要进行深入的挖掘和判断，对于科研人员和分析团队的要求较高，一旦分析错误可能会对研究产生不良的影响。
三、未来的技术发展目前基因测序技术仍然处于不断发展和改进的过程中，未来有望在一些方面实现更多的突破和进步。
小鼠基因鉴定常见问题_概述及解释说明
小鼠基因鉴定常见问题概述及解释说明1. 引言1.1 概述小鼠基因鉴定是一项关键的科学研究技术，它通过识别小鼠个体的遗传信息和基因组成，为我们解析小鼠表型和功能的分子基础提供了有力的支持。
随着基因研究的发展，对小鼠基因的认知越来越深入，小鼠逐渐成为了研究人类健康和疾病模型中不可或缺的工具。
1.2 文章结构本文将首先介绍小鼠基因鉴定常见问题方面的相关内容，包括针对什么是小鼠基因鉴定、常见的小鼠基因鉴定方法以及小鼠基因鉴定在科学研究中的应用领域等内容。
随后，我们将进一步解释说明进行小鼠基因鉴定的原因、意义和价值，并探讨这一领域未来发展的前景与趋势。
最后，在结论部分对总述概况进行归纳，并展望和建议关于小鼠基因鉴定问题的未来方向。
1.3 目的本文旨在全面了解和阐述小鼠基因鉴定常见问题，旨在帮助读者更好地理解和认识小鼠基因鉴定的重要性和意义。
通过阐述该领域的相关知识，我们希望能进一步促进和推动小鼠基因研究领域的发展，并为相关研究人员提供指导和参考。
2. 小鼠基因鉴定常见问题2.1 什么是小鼠基因鉴定：小鼠基因鉴定是指通过分析和检测小鼠DNA或RNA中的遗传信息，以确定小鼠个体的基因组中是否存在特定的基因变异或突变。
它可以帮助研究人员识别和验证与小鼠表型特征相关的关键基因。
2.2 常见的小鼠基因鉴定方法：常用的小鼠基因鉴定方法包括：- Polymerase Chain Reaction (PCR)：PCR是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可在体外扩增目标DNA片段。
通过PCR反应，我们可以对感兴趣的DNA区域进行快速而精确的放大，从而便于后续分析。
- Southern blotting：Southern blotting结合了电泳和杂交技术，能够检测目标DNA序列。
该方法适用于检测某一特定片段在小鼠基因组中是否存在。
- Northern blotting：类似于Southern blotting，但Northern blotting主要用于检测RNA分子。
sanger测序结果解读
sanger测序结果解读Sanger测序是一种常见的测序技术，它是由Frederick Sanger于1977年发明的。
Sanger测序技术通过利用DNA聚合酶合成DNA链的特性，逐个碱基地检测模板链，来确定DNA序列。
在Sanger测序结果解读中，我们可以通过电泳结果来解读所得到的DNA序列。
测序结果通常以一系列电泳图来呈现，每个电泳图对应一个碱基位点。
在每张电泳图上，我们可以看到几条不同长度的DNA片段，这些DNA片段是由DNA扩增和聚合酶链终止反应生成的。
而DNA扩增的基因片段长度会逐渐延长，直到与测序引物碱基配对错误而终止。
因此，每个电泳图上的DNA片段长度由碱基的数量决定。
解读Sanger测序结果第一步是标定碱基的分子量。
在每个电泳图上，我们通常会在左侧或上方列出已知长度的DNA分子量标准，这些标准作为参照物，帮助测序结果的准确解读。
通过比较未知样本片段的迁移距离和标准样品的迁移距离，我们可以确定碱基的分子量。
接下来，我们需要解析每个电泳图上的碱基序列。
在Sanger测序中，每个电泳图上的每个位置对应一个碱基。
通过观察电泳图上的峰值，我们可以确定每个碱基的出现次数，峰值越高，表示该碱基在该位置上的含量越多。
然后，我们需要将每个电泳图上的碱基序列连接起来，得到完整的DNA序列。
在连接过程中，需要注意检查每条序列的质量，以确定测序结果的准确性。
常见的质量指标包括测序片段的峰值质量值（Phred得分），峰值高度和峰值间距。
较高的质量值表示该位置的测序数据质量较高。
对得到的DNA序列进行进一步分析和解读。
这包括比对已知的基因组数据库，寻找到与样本DNA序列相似的序列，以及进行生物信息学分析来推断基因功能和编码蛋白质信息。
在Sanger测序结果解读中，还需要考虑到测序引物的选择和测序反应的敏感性。
测序引物的选择应基于目标DNA的特异性，以确保特定区域的序列能够被准确测序。
此外，Sanger测序结果中出现的低质量区域和错误碱基也是经常需要考虑和排查的。
DNA电泳常见问题分析讲课稿
D N A电泳常见问题分析DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。
DNA电泳常见问题分析
DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果.3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH,应经常更新电泳缓冲液.4、样品加入量：一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0。
5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。
当加样孔大时,样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辨认不清；反之则应适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
7.选择的实验材料要新鲜,处理时间不易过长。
8。
在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
11。
分光光度分析DNA的A280/A260小于1。
8;不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5％，并重复步骤2～8.12。
酚/氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时,促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基,而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合.胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
生物信息学数据分析的常见问题与解决方案
生物信息学数据分析的常见问题与解决方案生物信息学数据分析是现代生物学研究中至关重要的一项技术，它运用计算机科学和统计学的方法，对生物学数据进行分析和解释，以揭示生物学的基本原理。
然而，在进行生物信息学数据分析的过程中，常常会遇到一些问题，本文将介绍一些常见问题，并提供相应的解决方案。
1. 数据质量控制问题在生物信息学数据分析的过程中，数据质量是十分关键的。
而RNA测序、DNA测序等实验技术可能会导致数据质量的下降，如测序错误、低质量碱基等。
为了保证数据的准确性，需要进行数据质量控制。
常用的质控工具有FastQC、Trimmomatic等。
FastQC可用于快速评估测序数据的质量，而Trimmomatic则可进行质控和去除低质量的碱基和适配体序列。
2. 数据预处理问题在进行生物信息学数据分析之前，通常需要进行一系列的数据预处理步骤，如去除低质量碱基、去除适配体序列、过滤低比对质量的序列等。
此外，对于RNA测序数据，还需要进行剪切位点识别和过滤。
常用的工具有Cutadapt、STAR、HISAT2等。
Cutadapt可用于去除适配体序列，STAR和HISAT2则用于进行RNA测序数据的比对。
3. 基因型分析问题在分析个体的基因型数据时，可能会遇到多态性位点的识别和基因型的准确性评估问题。
为解决这些问题，可以利用GATK（Genome Analysis Toolkit）进行多态性位点的识别和基因型的准确性评估。
GATK提供了一系列的工具，用于进行单样本或多样本的SNP和INDEL的分析。
4. 表达谱分析问题分析基因的表达谱是生物信息学数据分析中的重要任务之一。
针对RNA测序数据，我们可以使用RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization）或kallisto等工具进行表达值的估计和基因表达差异分析。
这些工具可以通过对已知的基因转录本进行建模和估计，从而得到准确的基因表达量。
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DNA测序常见问题解析一．引物问题Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？A：这里分以下几种情况：1. PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。
（1）对于较短的PCR产物（<600 bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。
（2）对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。
由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。
（3）由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。
2. 有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。
3. 找不到克隆片段的扩增引物。
发生这种情况原因有2个：（1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。
比如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序：那么从T7引物末端到 Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。
解决的办法是采用M13 Forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。
（2）您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的反向互补序列。
或者您插入的片段可能不是您的目的片段，而是由于非特异性扩增出来的片段，还有可能您送过来的样品被污染。
Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。
1. 测序引入的错误对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域内（90-120 bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。
因此，首先要看原始的测序峰图在引物区内是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。
2. PCR/克隆过程尽管使用高保真聚合酶进行PCR出错的可能性比较少，但不排除PCR错配或者克隆过程中突变的可能。
有的人会问，PCR的突变怎么会出现在引物区呢？这是因为引物是单链，PCR产物引物区的互补链同样是以引物为模板进行扩增得到的，因此，有可能存在引物正确但其产物出错的情况。
针对这种情况的解决方法是：进行测序时请送2-3个独立的克隆子进行测序，这样可以排除PCR过程出错或克隆产生突变的情况。
3. 引物本身错误如前面所述，引物合成是一种多步骤的化学反应，即使每一步合成效率达到99%，仍有1%的序列不能连接或错误地连接下一个碱基，这些序列在经过Capping 后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；对于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Capping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。
被封闭的引物，在下一轮偶联时将不能继续参与合成。
对于实验中测序发现的较常见碱基缺失的可能原因如下：（1）由于DNA合成是沿着3'→5'端方向将碱基逐个连接上去的，每连上一个碱基，都需要经过 (Detritylation, Coupling, Capping, Oxidation)一个循环。
Coupling是上一个碱基的5'-OH 与下一个碱基的3'活性部分发生反应，该反应的效率最高可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；（2）Capping是将没有连接上下一个碱基的5'-OH乙酰化，Capping的效率不可能达到100%，没有被乙酰化的5'-OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；（3）Detritylation是脱掉上一个碱基5'-OH上的保护基，准备连接下一个新碱基，Detritylation的效率也不可能达到100%，没有脱保护的5'-OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列；对于插入突变，引物序列中往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分碱基发生丢失DMT，处于活性状态的新碱基在没有与上一个碱基反应前发生自连，将会造成碱基重复，故会发生插入同一碱基的突变的失败序列。
对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发生在G转换成其它碱基。
碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中DNA 聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发生G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。
脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。
引物合成过程中，造成碱基缺失、插入、置换突变的因素客观存在，上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。
但是基于目前大规模生产的纯化方法，还不能达到100%的纯度，对40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是ULTRA-PAGE；而对40 mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。
所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRA PAGE纯化或HPLC纯化的引物。
测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率不大，但是偶尔也会发生。
Q：如何选择（设计）测序用引物?A：引物的选择建议您尽量选用载体上的通用引物。
若载体上有几对引物结合位点，请根据您插入目的片段位点选择（引物3'端离您所测的目的片段50-100 bp 左右较适宜）合适的引物，同时区别引物的方向。
若没有合适的通用引物则需要按照以下测序引物的要求设计合成测序引物：1. 引物长度 20个碱基左右，3'端尽量选择G或C (不绝对)，以增加与模板的结合能力。
2. Tm温度应选择50-60℃左右，GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。
3. 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
4. 保证引物和模板100%匹配，尤其是3'端的几个碱基一定要100%，必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。
Q：PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?A：众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。
PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。
如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了，故PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。
而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。
在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。
因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。
这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。
要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。
二．重复测序中样品问题Q：验证实验不能用我新送来的样品进行吗？A：抱歉，不能。
我们会与您核对您原始样品的外观。
如果我们已经将样品送还，那么在结果确认前请保留我们的标记，以便一旦需要验证可以重新提供。
Q：我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？A：我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验。
如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那么实验原则和验证实验是相同的。
三．测序结果序列问题Q：你们给我的序列怎么在一串A/G/C/T后就没有信号了？A：重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。
我们目前的原则是对于质粒DNA（闭合双链）上当存在30个以上的poly T/A 时无论之后的信号质量如何，我们都会将报告发出，在PCR模板上这个限制的长度为15个碱基。
相对A/T，G/C的影响更大一些，无论在何种模板上只要出现连续10个G或C，不管之后的信号质量如何，我们都会将报告发出。
由于这样的重复序列对测序结果的影响是绝对的，所以还请测序客户在选择引物时尽量避开有重复序列的一端。
Q：你们给我的结果上怎么有这么多的错误？明明这里有一个A/G/C/T为什么没有读出来？A：通常情况下测序报告的前端30个碱基由于会受到荧光染料的干扰，可能会存在错误，为保证您能够得到完整的目的序列，请您在选择测序引物时务必谨慎；序列的可靠程度视图谱峰形的质量而定，我们通常提供650-700个有效碱基；自动测序仪解读序列的准确性并非100%，虽经过我们技术人员的检查，还是有可能会有错读和漏读的情况发生，要达到100%的准确性只有进行不同方向的多次测序。
Q：我的彩图和文件都丢了，能不能再给我提供一份？A：当然可以，不过出于保密原则我们的测序结果只保留6个月，而测序样品只保留1个月，所以您要追加实验或索取结果都需要抓紧时间Q：我要求5'到3'正向测序，为什么你们给我的序列是反的？A：您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。
我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3'引物和5'引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13F，M13R这样的形式来填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoR I到Hind III”。
我们手中的质粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。